1 / 56

Seminář UNCE 28.5.2012

Seminář UNCE 28.5.2012. UNIVERZITNÍ CENTRUM „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“ 4 cíle 4 senioři/14 juniorů. Rozpočet. Celkem 23,427 mil Kč (2012-2017) Podpora (2012) : 3,3645 mil Kč Dominantní složkou je mzdový fond

garan
Download Presentation

Seminář UNCE 28.5.2012

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Seminář UNCE 28.5.2012 • UNIVERZITNÍ CENTRUM • „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“ • 4 cíle • 4 senioři/14 juniorů UNCE 204021

  2. Rozpočet • Celkem 23,427 mil Kč (2012-2017) • Podpora (2012) : 3,3645 mil Kč • Dominantní složkou je mzdový fond • Rok 2012 : provozní náklady (175 tis Kč) kryjí náklady z Centra biomodelů • Projekt komplementuje PRVOUK, jež zajišťuje další prostředky pro platy a provoz. V neposlední řadě je projekt provázán s navazujícími granty. UNCE 204021

  3. Výsledky a jejich prezentace • Semináře 2x ročně (další bude 26.11. ve 12h) • Prezentace výsledků - veřejná • Webové stránky http://unce1.lf1.cuni.cz/ slouží jako informační centrum a vytvářejí historii grantovému projektu • Bude vytvořena tvář WEBu, jež bude upozorňovat na novinky – především prestižní publikace. UNCE 204021

  4. Cíl 1 Stopka et al. UNCE 204021

  5. Specifický cíl 1a Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.Cíl 2b. Studium molekulárních mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: T Stopka (1 a 2) Junioři: P Burda (2), V Pospíšil (2), N Čuřík (1), K Vargová (1) Další participace: P Vlčková (1), M Kapalová (1), T Zikmund (1) UNCE 204021

  6. Obecné principy • Experimentální hematologie: modelování funkce rozličných molekul, jež se účastní diferenciace kmenové buňky. • Myší transgenika: gene knockout (delece) a knock in (vnesení) v ES buňkách mechanizmem homologní rekombinace. UNCE 204021

  7. Molekulární úroveň • Transkripční faktory: PU.1 – hlavní regulátor diferenciace kmenové krvetvorné buňky, „leukemia suppressor“. • Chromatin remodelační faktory: Smarca5, skládá a rozkládá nukleozóm, účastní se dějů na DNA. • Postranskripční regulace: mikroRNA (inhibitory exprese). UNCE 204021

  8. Medicínská úroveň • Hematologické malignity: AML, CML, MDS, CLL – role vybraných molekul v downregulaci PU.1 (prognostický význam) • Epigenetická terapie (5-AZA u MDS): ovlivňuje krvetvorbu mechanizmem odblokování exprese některých tumor supresorových genů (např. PU.1). UNCE 204021

  9. Metodika • Experimentální modely: transgenní myši, derivované buněčné linie, genetická manipulace v buněčné linii. • Molekulární metodiky: vnesení nukleových kyselin do buňky, celogenomová analýza fenotypu, zobrazovací metodiky v myši, RNA FISH. UNCE 204021

  10. Role PU.1 u malignit krvetvorby PhD studium od r. 2006, juniorem od 6/2012 • 1) jaká je role 5-AZA v regulaci exprese genu PU.1 (Čuřík et al. 2011, Leukemia, IF:8,99). Chromatinová struktura genu PU.1 reaguje specificky na 5-AZA. Je možné využít testování odpovědi na 5-AZA in vitro na úrovni chromatinu (srovnání s OS pacientů). • 2) je gen pro PU.1 mutován u MDS? (deep sequencing). Ovlivňuje hladina PU.1 agresivitu MDS a AML (myší model – Vlčková et al 2012) N. Čuřík PhD studium od r. 2006 (juniorkou během 2. ½ 2012) K. Vargová UNCE 204021

  11. Role Smarca5 v krvetvorbě • 3) nepostradatelná role Smarca5 v krvetvorbě? Kondiciální delece v myši ukazuje na specifický defekt krvetvorby. (Kokavec et al. v přípravě) • 4) testování role Smarca5 jako onkogenu – kondiciální aktivace transgenu (knock in) – aktuálně na úrovni rekombinace ES buněk (T. Zikmund). UNCE 204021

  12. Transdiferenciace krvetvorných buněk PhD 2005-2011, Opletalova cena 1.LFUK za rok 2011 • 5) role rozličných hladin PU.1 v inhibici onkogenních mikroRNA (miR-17-92) a v produkci odlišných krevních elementů. Genetický program PU.1 – cílové geny a jejich schopnost „senzovat“ odlišné hladiny TF. • 6) role antagonizmu PU.1 a GATA-1 v regulaci liniové determinace. Jak 2 vzájemně se blokující transkripční faktory regulují produkci odlišných krevních elementů? V. Pospíšil PhD 2006-2011, řešitel GAUK a od r. 2012 GAČR postdoc P. Burda UNCE 204021

  13. Nejvýznamnější výstup • 5-azacitidine in aggressive myelodysplastic syndromes regulates chromatin structure at PU.1 gene and cell differentiation capacity. Curik N, Burda P, Vargova K, Pospisil V, Belickova M, Vlckova P, Savvulidi F, Necas E, Hajkova H, Haskovec C, Cermak J, Krivjanska M, Trneny M, Laslo P, Jonasova A, Stopka T. Leukemia. 2012 Feb 20. IF: 8,99 Teze publikace: • a) 5-AZA ovlivňuje chromatinovou strukturu a expresi genu PU.1 • b) 5-AZA vlivem na PU.1 zapíná krvetvornou diferenciaci • c) míra represe PU.1 u MDS koreluje s přežíváním na 5-AZA – plánuje se klinické testování (AZA/G-CSF) UNCE 204021

  14. Výstupy projektu • Další publikace (jen citace s uvedením IF) 0 • Pořádané odborné akce: Genes, Genetics & Genomics (G3) 2012. International Symposium on Gene Regulation in Normal and Pathologic States. http://g3.lf1.cuni.cz/ • Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF (1) a souhrnný IF (8,99). UNCE 204021

  15. Plánované aktivity Experimenty: Smarca5 - kondiciální delece v T buňkách (T Zikmund), Ctcf – interakce se Smarca5 (M. Kapalová), Smarca5 – kondiciální transgen v myši (T Zikmund) Publikace: Vlčková et al. (role inhibice PU.1 v agresivitě AML) těsně před odesláním Kokavec et al. před odesláním, zdržení při dokončování na straně kolaborátora (vliv kondiciální inaktivace Smarca5 v krvetvorbě) P. Vlčková UNCE 204021

  16. Cíl 2 Nečas et al. UNCE 204021

  17. Specifický cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: Emanuel Nečas Junioři: Jana Michalová Katarina Forgáčová UNCE 204021

  18. Základní uvedení do problematiky specifického cíle • kmenová krvetvorná buňka • progenitorová krvetvorná buňka • niche spolu tvoří základní funkční jednotku krvetvorby UNCE 204021

  19. Základní uvedení do problematiky specifického cíle (molekulární úroveň) Molekulární úroveň interakcí v základní funkční jednotce je studována z metodických důvodů většinou nepřímo: 1. narušením rovnovážného stavu např. ozářením, cytostatiky 2. genovou manipulací (knock-out, knock-in) UNCE 204021

  20. Základní uvedení do problematiky specifického cíle (medicínská úroveň) • transplantace kostní dřeně • nádorová hematopoeza • kmenové buňky v regenerační medicíně všeobecně UNCE 204021

  21. Konkrétní vědecké otázky • 1) podstata změněné zdatnosti (fitness) kmenových buněk myší UBC-GFP • 2) podstata snížené fitness kmenových buněk z regenerované krvetvorné tkáně UNCE 204021

  22. Konkrétní vědecké otázky • 3) obsazování a uzavírání nichí kmenovými a progenitorovými buňkami Terp53-/- • 4) latentní přítomnost dárcovských kmenových a progenitorových buněk transplantovaných neozářenému příjemci UNCE 204021

  23. Konkrétní vědecké otázky • 5) • 6) UNCE 204021

  24. Metodika (experimentální modely) • transplantace krvetvorné tkáně normálním, submyeloablativně a myeloablativně ozářeným příjemcům, sledování úrovně chimerismu (A/B ev. C a D) UNCE 204021

  25. Metodika (molekulární metody) • mRNA a miRNA profiling • PCR specifických kandidátních mRNA (adhezivní molekuly) • v separovaných buňkách LSK (asi 50 tisíc/femur x asi 1000 buněk kmenových) - ve stromatu krvetvorné tkáně (zbavené krvetvorby ozářením) UNCE 204021

  26. Nejvýznamnější výstup • Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců. Forgáčová et al: Timing of transplantation window... (BBMT) Forgáčová/Nečas: review (Folia Biol) • Teze publikace: • a) • b) • c) UNCE 204021

  27. Výstupy projektu • Další publikace (jen citace s uvedením IF) • Abstrakta a další výstupy. • Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF. UNCE 204021

  28. Plánované aktivity (experimenty) • je dokončována analýza „transplantačního okna“ u letálně ozářených myší • pokračuje analýza myší UBC-GFP ◊ zpracování a interpretace mRNA profilu v kadaverózní krvetvorné tkáni postrádající ATP (Illumina) UNCE 204021

  29. Problémy, potřeba spolupráce ... Illumina ... V kadaverózí „umírající“ tkáni kosní dřeně se postupně snižuje zastoupení desítek, stovek, a tisíců specifických mRNA ... Současně se ZVYŠUJE zastoupení skoro stejného počtu jiných mRNA ... ????? UNCE 204021

  30. Cíl 3 Klener et al. UNCE 204021

  31. Specifický cíl č.3: Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukémií a lymfomů Senior: doc. Jan Živný, Ph.D. Junioři: MUDr. Pavel Klener, Ph.D., MUDr. Jan Molinský, MUDr. Magdalena Klánová, MUDr. Bokang Maswabi UNCE 204021 UNCE 204021

  32. Základní uvedení do problematiky specifického cíle Obecné principy -imunodeficientní myši umožňují engraftment buněčných linií lidských leukémií a lymfomů v myším organismu -růst xenotransplantátu v myším organismu umožňuje preklinické studium role mikroprostředí, šíření tumoru, novotvorby cév či experimentální in vivo terapii UNCE 204021 UNCE 204021

  33. Základní uvedení do problematiky specifického cíle Molekulární úroveň Bude studována změna genové exprese a fenotypu buněk rostoucích in vivo v porovnání s in vitro rostoucími liniemi Bude studován vliv cílené změny exprese vybraných genů (např. adhezivních molekul) na engraftment, růst, šíření a neovaskularizaci xenotransplantovaných tumorů. UNCE 204021 UNCE 204021

  34. Základní uvedení do problematiky specifického cíle Medicínská úroveň -myší model lidské leukémie a lymfomu nám umožní studium patogeneze lidských malignit na preklinickém modelu -myší model bude sloužit pro preklinické zhodnocení účinnosti vybraných protinádorových látek UNCE 204021 UNCE 204021

  35. Konrétní vědecké otázky 1) charakterizace engraftmentu a šíření buněk linií lymfomu z plášťových buněk (MCL) v jednotlivých myších orgánech pomocí imunohistochemie a průtokové cytometrie 2) studium genové exprese a fenotypu buněk MCL buněk získaných ex vivo z myších orgánů ve srovnání s in vitro rostoucími MCL liniemi. UNCE 204021 UNCE 204021

  36. Konrétní vědecké otázky 3) role exprese adhezivních molekul CD31/PECAM a CD44/Hermes v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů 4) role exprese VEGF receptorů (VEGFR1, 2, 3) v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů UNCE 204021 UNCE 204021

  37. Konrétní vědecké otázky 5) studium molekulárních mechanismů regulujících neovaskularizaci podkožních MCL tumorů 6) experimentální terapie MCL pomocí anti-angiogenních léčiv UNCE 204021 UNCE 204021

  38. Metodika Experimentální modely: Počítá se se stabilní kohortou cca 80-120 myšek v pokuse + cca 60-80 myšek v chovném jádře Molekulární metodiky: příprava transgenních linií se stabilně zvýšenou či sníženou expresí vybraných genů studium změn genové exprese pomocí real-time RT-PCR a mikročipů studium proteinové exprese pomocí western blottingu a průtokové cytometrie izolace buněčných subpopulací pomocí magnetických kolon UNCE 204021 UNCE 204021

  39. Nejvýznamnější výstup Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců: Mouse model of human mantle cell lymphoma (MCL) for the study of MCL biology and for preclinical assessment of experimental treatment approaches. Teze publikace: a) Myší model MCL je biologicky podobný agresivní blastoidní variantě MCL u člověka b) MCL buňky rostoucí v myši mají odlišný fenotyp v porovnání s MCL buňkami rostoucími in vitro c) Experimentální terapie blastoidního MCL: cisplatina vykazuje významný protilymfomový efekt v terapii blastoidního MCL UNCE 204021 UNCE 204021

  40. Výstupy projektu Další publikace (jen citace s uvedením IF) Zatím ne Abstrakta a další výstupy. Zatím ne Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF. UNCE 204021 UNCE 204021

  41. Plánované aktivity Experimenty: 1. Charakterizace myšího modelu MCL za použití xenotransplantace primárních buněk izolovaných od pacientů s blastoidním MCL. Primární buňky, které nerostou in vitro, lze „propagovat“ pomocí sériových transplantací v imunodeficientních myších  vliv mikroprostředí myšího organismu= experimentální model blíže biologii MCL u člověka. 2. Charakterizace dvou nových linií MCL odvozených od 2 pacientů s MCL: UPF1E, UPF2A. Včetně xenotransplantací do imunodeficientních myší. Publikace: zatím ne. UNCE 204021 UNCE 204021

  42. Cíl 4 Šedý et al. UNCE 204021

  43. Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování rozličných tkání Senior: Doc. René Foltán Junioři: Dr. Jiří Šedý Dr. Jiřina Nieblerová Dr. Erika Kužmová unce204021 UNCE 204021 UNCE 204021

  44. Základní uvedení do problematiky specifického cíle Cílem projektu je posoudit možnosti implantace kmenových buněk a osteoindukčních biomateriálů do kostěných defektů na modelu laboratorního potkana. UNCE 204021 UNCE 204021

  45. Základní uvedení do problematiky specifického cíle MSCs reprezentují v současné době roli hlavního kandidáta v regenerativní medicíně, včetně augmentace kosti, pomocí přímých i nepřímých mechanismů, kterými potencují regeneraci kosti. Lepší pochopení těchto mechanismů umožní zdokonalit techniky lokální terapie kostních defektů, optimalizaci jejich využití, indikací a napomůže maximální využití jejich společných účinků s biomateriály UNCE 204021 UNCE 204021

  46. Základní uvedení do problematiky specifického cíle MSCs mají obrovský terapeutický potenciál, který je zatím jen velmi málo využitý. Neexistují žádné spolehlivé selektivní markery pro MSCs. I proto jsou vlastnosti MSCs stále neprobádané. Jedna z teorií o MSCs předpokládá „MSCs niche“ centralizovanou v jednom orgánu/tkáni, odkud jsou MSCs mobilizované a migrují k místu léze, ale zabezpečují i neustálou fyziologickou obnovu tkání. UNCE 204021 UNCE 204021 UNCE 204021

  47. Základní uvedení do problematiky specifického cíle Incidence MSCs v tkáních není dostatečná a pro terapeutické cíle je nutná jejich expanze ex vivo. MSCs izolované z různých tkání sa mírně od sebe liší nejen fenotypově, ale i terapeutickým potenciálem. Podmínky in vitro kultivace zásadně ovlivňují přežívání, proliferaci, diferenciaci a jiné vlastnosti MSCs in vivo. Stále přibývající práce o 3-D kultivaci MSCs in vitro ukazují, že 2-D kultury velmi zkreslují přirozené projevy MSCs (produkce jiných signálních molekul, exprese jiných povrchových markerů, ...). UNCE 204021 UNCE 204021 UNCE 204021

  48. Konkrétní vědecké otázky 1) Jak nejlépe MSCs kultivovat 2) Jak nejlépe MSCs a biomateriály aplikovat na místo určení UNCE 204021 UNCE 204021

  49. Konkrétní vědecké otázky 3) Jaká doba je nutná k reparaci kostěného defektu 4) Jaká je kvalita reparované kosti UNCE 204021 UNCE 204021

  50. Konkrétní vědecké otázky 5) Jaký je osud MSCs v lézi UNCE 204021 UNCE 204021

More Related