RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE

1. RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE

2. L’infezione tubercolare • I micobatteri vengono liberati nell’aria, all’interno di goccioline di saliva (droplet nuclei), dai soggetti affetti da tubercolosi polmonare • I droplet <5μm rimangono a lungo in sospensione nell’aria e, se inalati, possono raggiungere gli alveoli polmonari • Negli alveoli i micobatteri vengono fagocitati dai macrofagi non attivati ma riescono a moltiplicarsi al loro interno uccidendoli • Il processo flogistico e l’attivazione dei macrofagi riescono, nella grande maggioranza dei casi, ad arginare l’infezione con formazione del processo primario • Nel 5% dei casi si instaura la malattia tubercolare (primaria) • La tubercolosi (post-primaria) può manifestarsi, nel 5% degli infetti, per riattivazione del processo primario in seguito all’abbassamento delle difese immunitarie

3. Il Mycobacterium tuberculosis nel sangue • Una breve fase batteriemica può aversi durante l’infezione primaria allorché alcuni micobatteri possono passare nel torrente circolatorio, per via linfatica, e raggiungere i distretti più disparati • Una fase batteriemica prolungata si ha nelle forme disseminate (tubercolosi miliare)

4. Le micobatteriosi • Le infezioni da micobatteri non tubercolari si acquisiscono dall’ambiente • La via di ingresso può essere respiratoria o alimentare • La malattia si instaura soltanto in presenza di fattori predisponenti fra le quali il principale è l’abbassamento delle difese immunitarie • Forme più comuni: • respiratoria (terza età) • linfoghiandolare (infanzia) • intestinale (AIDS) • disseminata (AIDS) • Nella forma disseminata si ha micobatteriemia prolungata

5. Breve storia dell’emocoltura per micobatteri • 1917    M. C. Clough. The cultivation of tubercle bacilli from circulating blood in miliary tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. • 1932 L. Shapiro. The frequency of bacillemia in tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. • 1935 K. A. Jensen. Report on investigations regarding the Loewenstein technique of culturing tubercle bacilli from blood. Acta Tuberc.Scand. • 1980 W. Landau, J. Feczko, and R. L. Kaplan. Radiometric detection of mycobacteria in routine blood cultures. J.Clin.Microbiol. • 1983 J. L. Elliott, W. L. Hoppes, M. S. Platt, J. G. Thomas, I. P. Patel, and A. Gansar. The acquired immunodeficiency syndrome and Mycobacterium avium-intracellulare bacteriemia in a patient with hemophilia. Ann.Intern.Med. • 1984 L. Srtockman, G. D. Roberts, and D. M. Ilstrup. Effect of storage of the Du Pont lysis-centrifugation system on recovery of bacteria and fungi in a prospective clinical trial. J.Clin.Microbiol. • 1988 M. B. Agy, C. K. Wallis, J. J. Plorde, L. C. Carlson, and M. B. Coyle. Evaluation of four mycobacterial blood culture media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar, and a biphasic medium. Diagn.Microbiol.Infect.Dis.

6. Il prelievo • Campione di sangue • direttamente nel flacone solo con i flaconi dedicati ai micobatteri • problema dei flaconi radioattivi • in assenza di flaconi dedicati • in provetta (almeno 5 ml) con eparina • in provetta con SPS • Numero di prelievi • tre, preferibilmente in giorni diversi e prima dell’inizio della terapia; ininfluente il momento del prelievo • Conservazione del prelievo • a temperatura ambiente, anche per alcuni giorni

7. Diagnostica delle micobatteriemie • Esame microscopico (inutile) • Esame colturale • primi approcci rudimentali • semina dopo lisi-centrifugazione • semina diretta in terreno liquido dedicato • Amplificazione genica (problematica)

8. La lisi-centrifugazione • Anticoagulante SPS, saponina • Centrifugazione per 30 min • Aspirazione e scarto del supernatante • Semina del sedimento su: • terreno solido (possibilità di conta) • terreno liquido o bifasico

9. I terreni liquidi per emocoltura • Semina diretta • BACTEC 13A • BacT ALERT MB Blood • BACTEC MYCO/F Lytic • permette anche l’isolamento dei miceti • Semina previa lisi-centrifugazione • Middlebrook 7H9 • BACTEC 12B • BacT ALERT MP Process • ESP Myco

10. I sistemi automatici • BACTEC 460TB • radiometria: liberazione di CO2 radiomarcata • MB/BacT Alert 3D • refrattometria: variazione dell’intensità luminosa di un raggio in seguito alla riflessione su un sensore di CO2 • BACTEC, serie 9000/F • fluorimetria: emissione di fluorescenza da parte di un sensore di O2 • ESP II • pressometria: rilevamento della diminuzione di pressione conseguente al consumo di O2

11. Sintesi delle procedure di laboratorio 1 • Eventuale trasferimento nel flacone da emocoltura • Incubazione per 60 gg. o fino al momento della positivizzazione • In caso di positività strumentale • preparato microscopico, per mettere in evidenza microorganismi alcol-acido resistenti • in caso di positività del vetrino, semina su terreno specifico per micobatteri • semina su terreno non specifico per micobatteri e non selettivo, per evidenziare eventuali contaminazioni • ripresa dell’incubazione in caso di negatività del preparato e della coltura

12. Sintesi delle procedure di laboratorio 2 • Test di ibridizzazione mediante DNA-probe sulle colonie micobatteriche cresciute nella subcoltura • M. tuberculosis complex • identificazione biochimica a livello di specie • antibiogramma • identificazione come micobatterio non tubercolare appartenente ad una delle 15 specie di più frequente isolamento • identificazione come micobatterio non tubercolare non appartenente a nessuna delle 15 specie di più frequente isolamento • identificazione a livello di specie mediante HPLC o test biochimico-colturali

13. Emocolture “non negative” • Fra campioni segnalati come positivi dall’apparecchio automatico sono incluse • le vere positività • le “contaminazioni” • le false positività transitorie

14. Interpretazione dei risultati • Non essendo i micobatteri presenti sulla cute, in caso di positività dell’emocoltura per micobatteri, la contaminazione del campione non è ipotizzabile ed anche un solo isolamento è da ritenersi significativo

15. Emocolture per micobatteri eseguite negli ultimi 12 anni

16. Percentuali di positività

17. Mycobacterium avium complex

18. Mycobacterium tuberculosis

19. Altri micobatteri

20. Tempi di positivizzazione, in settimane

21. Cinetica di crescita di alcune specie micobatteriche

22. Infezioni micobatteriche e livello dei linfociti CD4+ M. tuberculosis MAC

23. Considerazioni sulla nostra casistica • Le prime micobatteriemie sono comparse con qualche anno di ritardo rispetto agli USA • Nei primi anni si isolava quasi esclusivamente il M. tuberculosis • Repentina impennata dei MAC negli annicentrali dell’ultimo decennio del secolo scorso • Nessun ritardo, per l’isolamento di altre specie micobatteriche, rispetto ad altri paesi • Con l’introduzione degli inibitori delle proteasi, gli isolamenti di MAC, peraltro già in flessione, sono quasi scomparsi • Ancora tutta da valutare l’inattesa impennata di isolamenti dell’ultimo anno

24. Coltura del sangue mestruale • Sistema di elezione per la diagnosi di annessiti tubercolari • Raccolta sterile problematica • Alte percentuali di contaminazioni

25. Conclusioni • Dopo gli incrementi vertiginosi degli anni ’90 la richiesta sembrava essersi stabilizzata; nell’ultimo hanno ha presentato però un brusco incremento • La percentuale di positivizzazione oscilla attorno al 1% • Probabilmente c’è spazio per una riduzione delle richieste, ma l’utilità dell’emocoltura per micobatteri non è in discussione • Gli isolamenti di M. avium sono stati drasticamente ridimensionati dai progressi nella terapia anti-retrovirale • Gli isolamenti di M. tuberculosis sono rimasti pressoché invariati • Gli isolamenti di altre specie sono diventati eccezionali • Non è possibile prescindere dall’impiego di terreni liquidi • La consuetudine di eseguire il test su tre campioni non sembra giustificata • L’ incubazione dovrebbe essere prolungata fino ad otto settimane