La ricerca delle aflatossine totali nel mais

1. La ricerca delle aflatossine totali nel mais Con metodo HPLC

2. Normativa • Per quanto riguarda il mais per uso alimentare umano, i limiti di aflatossine (in µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del 2006 • mais da sottoporre a selezione o altro trattamento prima del consumo o del suo utilizzo come ingrediente per alimenti → AFB1=5,0; totali=10,0 • Cereali e derivati, tra cui i prodotti alimentari a base di cereali → AFB1=2,0; totali=4,0

3. Normativa • Per quanto riguarda l’uso mangimistico per animali i limiti di AFB1 (in ppm di prodotto con umidità al 12%) sono contenuti nel D.Lgs. 149 del 2004 • Tutte le materie prime ad uso mangimistico → 0,02 • Prodotti per bovini, capre e pecore → 0,02 (tranne prodotti per bestiame da latte → 0,005 e prodotti per agnelli e vitelli → 0,01) • Prodotti per polli e maiali (tranne quelli giovani) → 0,02 • Altri prodotti completi → 0,01 • Prodotti aggiuntivi per bovini, capre e pecore (tranne i prodotti aggiuntivi per bestiame da latte, agnelli e vitelli) → 0,02 • Prodotti aggiuntivi per maiali e polli (tranne quelli giovani) → 0,02 • Altri prodotti aggiuntivi → 0,005

4. Il principio del metodo Per estrarre le aflatossine dal campione da analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver filtrato, per purificare una parte del filtrato si utilizza una cartuccia di florisil e poi una di C18; La separazione e la determinazione successive si effettuano con sistema HPLC, utilizzando una colonna C18 a fase inversa, poi si effettua una derivatizzazione con una soluz. di iodio satura e, infine, una quantificazione, utilizzando un rivelatore a fluorescenza.

5. I reattivi • Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%) • Metanolo • Propanone (acetone) • Soluzione acetonelacqua (98:2) • Soluzione acqualmetanolo (80:20) • Soluzione acqualacetone (85:15) • Eluente per HPLC, costituito da una soluzione acqualmetanolo/acetonitrile(130:70:40), i tre solventi devono essere per HPLC • Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare) • Celite 545 o simile trattata con acido • Cartucce di florisil • Cartucce di C18 • Standard di aflatossine • Standard di aflatossine da 1 μg/ml circa

6. Concentrazione con metodo spettrofometrico A = assorbanza • Registrare lo spettro ultravioletto della soluz. nell’intervallo 330 - 370 nm contro la soluzione benzene/acetonitrile(9:1); trovare l‘A del pto. di massimo e trovare la concentraz. con la questa formula: AF(μg/ml)= (A ∙ PM ∙ 1000) / E A: assorbanza nel pto. di max PM: peso molecoaredell'AFB1 E: coeff. di estinz. molare

7. PM e E delle principali aflatossine

8. reattivi • Infine, per quanto riguarda la soluz. di calibrazione, prima del suo utilizzo, portare lo standard da 1 μg/ml alla T ambiente; trasferirne una parte in recipiente tarato, in modo da poter ottenere uno standard diluito da 4 ng/ml circa di AF in acqualacetone. Usare questo standard diluito per ottenere da esso una serie di soluz. di calibrazione. Mantenerle alla temperatura di 4 °C e al buio. Preparando gli standard ed effettuando le analisi, bisogna evitare l’esposizione alla luce diretta e la presenza di NaClO sotto forma di vapore, che possono decomporre le AF. La vetreria nuova va sottoposta a trattamento, utilizzando una soluz. 2 N di acido solforico per 12 ore, prima di poter essere lavata normalmente.

9. L’apparecchiatura • Tritacarne • Agitatore meccanico • Bilancia analitica • Rotavapor • Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o un’altra simile • Filtro con pori di diametro 0,45 fvn • Colonna di vetro, con un diametro interno di 1 cm circa e una lunghezza di 30 cm circa con attacco luer • Rubinetto di nylon con attacco luer • Siringa da 10 ml con attacco luer • Cromatografo HPLC

10. L’apparecchiatura • Colonna C18 per HPLC da 311 o da 5 u • Pompa HPLC per la soluz. di iodio • Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per 0.75 nun • Spirale di reaz. in teflon o in acciaio inox, avente delle dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm • Bagno termostato a olio o acqua a 60 °C con regolazione della temperatura (± 0.1 °C) • Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm ed emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria nella cella a flusso. • Integratore elettronico

11. Avvertenza AF = aflatossine Le aflatossine sono cancerogenee quindi devono essere maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita, rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine in soluzione acquosa, evitando quindi quelli portati a secchezza. Infatti queste sostanze, essendo particolarmente elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente nell‘ambiente circostante. In caso di versamento accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClOall'l %, lasciare reagire per 10 mine successivamente utilizzare una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30 mine poi lavare con cura.

12. Il procedimento: preparazione del campione ed estrazione

13. Il procedimento: purificazione

14. Il procedimento: purificazione

15. Il procedimento: purificazione

16. Il procedimento: determinazione HPLC

17. Il procedimento: determinazione HPLC

18. Calcoli II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è calcolato con questa formula: AF = (m ∙ Vn) / (Vm ∙ M ∙ Vf ∙ 250) Dove: m = quantità di AF (espressa in ng) che si ottiene dal picco del campione estratto, e che si calcola sulla curva di regress. lineare Vn = i ml di estratto di campione che sono stati iniettati Vm= il ml finali dell'estratto di campione M = la massa (g) del campione Vf = il volume (ml) del filtrato ottenuto 250 = i ml di CHCl3 usato per estrarre il campione Se l’analisi e stata effettuata secondo le indicazioni la formula diventa: AF (espressa in μg/kg) = 20 ∙ m

19. Fonti • ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli, Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN 96/34 • RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di Bologna • http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0005:0024:IT:PDF • http://www.confindustria.tn.it/confindustria%5Ctrento%5Cnews.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File/Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.%20149.pdf?OpenElement