Mida histoonide modifikatsioonid tähendavad: histooni koodi hüpotees

1. Mida histoonide modifikatsioonid tähendavad: histooni koodi hüpotees Olgugi, et osadel juhtudel on võimalik leida otsene seos histoonide modifikatsioonide ja kromatiini struktuuri vahel, on siiski suur osa modifikatsioone, mis ei peaks otseselt kromatiinile mõju avaldama. Seetõttu pakkusid Brian Strahl ja David Allis 2000. aastal välja hüpoteesi, et tegelikult moodustavad histoonide modifikatsioonid omalaadse mustri, mis on iseloomulik ühele või teisele kromatiini olekule (heterokromatiinile, aktiivselt transkribeeritavale kromatiinile, jne). Seda nimetatakse “histooni koodiks” ning koos DNA modifikatsioonide mustriga võib seda kokku nimetada “epigeneetiliseks koodiks” Histooni koodi hüpoteesi eelduseks on see, et leidub miski, mis suudab seda koodi lugeda ja siis vastavalt tegutseda.

2. Kes loeb histooni koodi? BROMOdomään on valgustruktuur, mis seondub spetsiifiliselt atsetüleeritud lüsiinijääkidega. Bromodomään moodustub umbes 110-st aminohappejäägist ning domääni struktuurile on iseloomulik 4-st a-heeliksist koosnev kimp koos neid ühendavate suure (joonisel ZA) ja lühikese (BC) linguga. Lingud moodustavad õige suuruse ja kujuga “tasku”, mis sobib täpselt atsetüül-lüsiiniga seondumiseks. Gcn5 bromodomään seondunult H4K16Ac peptiidiga

3. Bromodomään Bromodomääni sisaldavad paljud kromatiini srtuktuuri modifitseerivad ensüümid, sealhulgas ka histoonide atsetüültransferaasid ja mõned basaalsed transkriptsioonifaktorid. Histoonide atsetüültransferaasid: Gcn5, p300, PCAF Kromatiini remodeleerivad kompleksid: SWI/SNF, RSC, NURF, BAF Basaalsed transkriptsioonifaktorid: TFIID, Mediator Kuna mõned histoonide atsetüültransferaasid (näiteks Gcn5) omavad bromodomääni ning samal ajal ka atsetüleerivad histoone, siis kujuneb välja olukord, kus HAT hakkab iseenda kohalolekut soodustama. Asi algab siiski sellest, et geeni promootoralaga DNA järjestus-spetsiifiliselt seonduvad transkriptsiooni aktivaatorid toovad kohale SAGA kompleksi, mille hulka kuulub ka Gcn5. Edasi aga saab SAGA ise hakkama ning kokkuvõtteks kujuneb geeni promootorpiirkonnale “transkriptsiooniline mälu” – geeniekspressioon kestab veel mõnda aega pärast aktivaatori kadumist.

4. Bromodomään Erinevate valkude bromodomäänid on sarnased (nad kõik tunnevad ära atsetüül-lüsiini), kuid ikkagi veidi erinevad. Need erinevused viivad selleni, et bromodomäänid on rohkem või vähem selektiivsed ning seonduvad atsetüül-lüsiiniga vaid sobivas kontekstis. Seondumise spetsiifika tuleneb puhtalt bromodomäänist, sest kui näiteks TAF250-le panna külge Brd2 bromodomään, siis hakkab ta ära tundma AcK12 H4 TAF 250 – basaalne transkr. faktor, TFIID subühik Brd2 – basaalne transkr. Faktor, Mediatori subühik PCAF - HAT Lüsiinide atsetüleerimine toimub ka teistel valkudel peale histoonide ning bromodomäänid on olulised ka nendele valkudele seondumisel.

5. Kes loeb histooni koodi? KROMOdomään on valgustruktuur, mis seondub spetsiifiliselt metüleeritud lüsiinijääkidega. Kromodomään kirjeldati algselt kahel erineval Drosophila epigeneetilisel repressoril: valkudel HP1 (seondub H3K9met) ja Polycomb (seondub H3K27met). Hiljem leiti seda domääni ka teistes kromatiini srtuktuuri modifitseerivates valkudes. Histoonide metüültransferaasid: SUV39 Kromatiini remodeleerivad kompleksid: CHD1, CHD3, Mi-2 Lisaks metüül-lüsiinidega seondumisele võivad mõned kromodomäänid seonduda ka DNA või RNA-ga.

6. Kes loeb histooni koodi? SANT-domään on valgustruktuur, mis seondub spetsiifiliselt histoonide modifitseerimata N-terminaalsete osadega, kuid on oluline ka valgu seondumisel DNA-ga. Domään moodustub umbes 50-st aminohappejäägist. SANT-domääni sisaldavad mõned kromatiini modifitseerivad valgukompleksid ja basaalsed transkriptsioonifaktorid (Swi3, Ada2, N-CoR, TFIIB). Histoonide metüültransferaasid: EZH1, EZH2 Kromatiini remodelleerivad kompleksid: ISW1, ISW2 Basaalsed transkriptsioonifaktorid: TFIIB

7. Milleks kromatiini modifitseerida? Kromatiini struktuuri muutmise ja histoonide modifitseerimise teglikuks eesmärgiks on kas tagada rakuliste faktorite juurdepääs DNA-le (näiteks transkriptsiooni aktiveerimiseks) või siis seda iga hinna eest ära hoida (transkriptsiooni repressiooniks). Samas on olukordi, kus raku või geeni “sisemine soov” tuleb maha suruda ning lähtuda üldisematest põhimõtetest. Näiteks DNA replikatsiooni käigus tuleb pääseda ligi kõikidele kromatiini piirkondadele, samuti tuleb DNA kahjustused parandada kõikjal genoomis. Seetõttu on vajalik, et kromatiini struktuuri ja olekut saaks aeg-ajalt muuta ja modifitseerida. Kromatiini muutmiseks on kaks põhilist võimalust: histoonide kovalentne modifitseerimine ja nukelosoomide liigutamine ehk kromatiini remodelleerimine.

8. Histoonide atsetüül-transferaasid Kõige laiemas skaalas jaotatakse histoonide atsetüül-transferaasid (HAT) kaheks: Type B – need paiknevad ja töötavad tsütoplasmas ning on vastutavad atsetüleerimiste eest, mis toimuvad kohe pärast histoonide sünteesi. Enamasti on tegu modifikatsioonidega, mis on vajalikud nukleosoomide sünteesil. Type A – need on tuumas ja tegelevad histoonide modifitseerimisega siis, kui need on juba kromatiini koosseisu lülitatud. Kuna kromatiinis toimuvad muudatused ja nende regulatsioon pakuvad inimestele suuremat huvi, siis valdava osa teadlaste tähelepanu on olnud suunatud just nende HAT-ide uurimisele.

9. Histoonide atsetüül-transferaasid Teine võimalus HAT-e liigitada, on vaatata nende ensüümide primaarstruktuuri ja üldist funktsiooni. Selles klassifikatsioonis jaotatakse HAT-id järgnevalt: GNAT family - (Gcn5-related N-acetyltransferase) – siia kuulub ka Gcn5, mida on kõige rohkem uuritud ja ka kõige otsesemalt transkriptsiooni regulatsiooniga seotud HAT. Siia klassi kuuluvad ka Hat1, Hpa1 ja PCAF. MYST family – (MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2,Tip60), neile lisaks veel Esa1 ja MOF. p300/CBP – see on ka oma klassi ainus esindaja General transcription factors – TAF250 (TFIID subühik), TFIIIC Tuumaretseptorite koaktivaatorid – SRC1, ACTR, TIF2 Põhjalikumalt on uuritud GNAT ja MYST perekondade ensüüme.

10. Histoonide atsetüül-transferaasid HAT-id ei tegutse üksi. Kuigi in vitro on iga HAT on võimeline atsetüül-transferaasi reaktsiooni läbi viima, on need ensüümid in vivo alati mõne suurema valgukompleksi osaks. Näiteks Gcn5 kuulub reeglina kompleksi SAGA, milles on veel vähemalt 16 valku. Samas võib Gcn5-te leida ka teistsugustest kompleksidest (millel tavaliselt on siiski mõningane sarnasus SAGA-ga või vähemalt on seal veel teisigi SAGA subühikuid). SAGA atsetüleerib histoone H3 ja H2B. Veel mõningaid HAT komplekse: NuA4 – katalüütiline subühik Esa1, atsetüleerib histoone H4 ja H2A NuA3 – katalüütiline subühik Sas3, atsetüleerib histooni H3 SAS – katalüütiline subühik Sas2, atsetüleerib histooni H4K16 Kuidas nimed tulevad? Näiteks nii: SAS – something about silencing

11. Histoonide atsetüül-transferaasid Miks ei võiks HAT tegutseda üksi, milleks talle valgukompleks? 1. Kuna HAT üksinda on suhteliselt madala spetsiifikaga ensüüm, siis suurema valgukompleksi koosseisus olemine aitab täpsustada, millisele substraadile seonduda ja mida atsetüleerida. Seega saab teiste subühikute kaudu reguleerida HAT-i aktiivsust. 2. Sageli on histoonide atsetüleerimise mõte aktiveerida mõne geeni transkriptsiooni, kuid ainult histoonide atsetüleerimisest ei piisa, et transkriptsioon toimuma hakkaks. Seetõttu on kujunenud nii, et transkriptsiooni aktivaatorid seonduvad suuremate valgukompleksidega, mis sisaldavad endas märkimisväärset osa transkriptsiooniks vajalikke faktoreid, mille hulka kuulub ka mõni HAT. Seega on HAT-id pigem transkriptsioonimasina “standardvarustuseks”. Näiteks TAFII250 on basaalse transkriptsioonifaktori TFIID koostisosa ning ka SAGA-t on viimasel ajal juba hakatud lugema basaalseks transkriptsioonifaktoriks

12. Histoonide atsetüül-transferaasid Kokkvõttes käib tüüpiline HAT-i kasutamine transkriptsioonis nii: 1. Transkriptsiooni aktivaatorid seonduvad järjestus-spetsiifiliselt geeni promootoriga ning samal ajal ka HAT kompleksiga. 2. HAT kompleks atsetüleerib promootori piirkonnas histoonid, tekitades seondumissaidid bromodomääniga valkudele (mille hulka kuuluvad nii HAT-id ise kui ka teised kromatiini modifitseerivad valgud) 3. Toimub promootori osaline või täielik vabastamine nukleosoomidest ning transkriptsiooni initsiatsioon. (H3/H2B) (H4/H2A)

13. Histoonide atsetüül-transferaasid Lisaks transkriptsiooni reguleerimisele on HAT-id seotud ka teiste rakuliste protsessidega, näiteks: Heterokromatiini reguleerimisega. Pärmi telomeeridel moodustub Sir valkude abiga heterokromatiin. Selle protsessi üheks etapiks on histooni H4 Lys16 deatsetüleerimine Sir2 valgu poolt. Et heterokromatiin ei leviks aktiivselt trankribeeritavatesse piirkondadesse, tuuakse transkriptsiooni käigus kohale SAS kompleks, mis tegeleb aktiivselt H4 K16 atsetüleerimisega. Selle tulemusena heterokromatiini levik peatub. DNA reparatsiooniga. Kui imetaja rakkudes inaktiveerida Tip60 HAT, siis nendes rakkudes on probleeme DNA kaheahelaliste katkete parandamisega ning apoptoosi indutseerimisega. Ilmselt on histoonide atsetüleerimine DNA katkete piirkonnas vajalik reparatsiooni efektiivseks töötamiseks. Samuti on Hat1 vajalik DNA kaheahelaliste katkete parandamiseks pärmis ning Gcn5 UV kiirgusest põhjustatud DNA kahjustuste parandamiseks imetaja rakkudes.

14. Histoonide deatsetülaasid Histoonide deatsetülaasid (HDAC) on ensüümid mis eemaldavad atsetüülrühma histoonide N-terminuse lüsiinidelt. HDAC-e klassifitseeritakse nende primaarstruktuuri sarnasuste alusel nelja erinevasse klassi: Klass I on pärmi Rpd3-ga sarnased valgud. Siia kuuluvad veel Hos1, Hos2, HDAC 1, 2, 3 ja 8. Klass II on pärmi Hda1-ga sarnased valgud. Siia kuuluvad veel Hos3, HDAC 4, 5, 6N, 6C, 7, 9 ja 10 Klass III on pärmi Sir2-ga sarnased valgud. Siia kuuluvad veel Sirt1-7, Hst1, 2, 3 ja 4 Klass IV ainus esindaja on HDAC 11 Klass III HDAC-id on kõikidest teistest oluliselt erineva struktuuriga ning nende aktiivsuseks on vajalik kofaktorina NAD (nicotinamide adenine dinucleotide).

15. Histoonide deatsetülaasid Ka HDAC-id on multisubühikulised kompleksid ning enamasti on nad võimelised deatsetüleerima kõiki histoone, kuid sõltuvalt valgukompleksist võib neil olla eelistusi mõnede konkreetsete lüsiinijääkide suhtes. Näiteks Rpd3 deatsetüleerib eelistatult histooni H4 K5, K8 ja K12. Transkriptsiooni repressioonil tuuakse aktiivselt HDAC-e nendesse kromatiini piirkondadesse, kus neid on vaja. Näiteks pärmi Ume6 transkriptsiooni repressor seondub Rpd3 HDAC kompleksiga ning toob selle represseeritavatele promootoritele. Samuti kuuluvad HDAC-id mitmete üldisemate transkriptsiooni repressorite ja hetrokromatiini tekitavate valgukomplekside koosseisu. Näiteks imetajate HP1 valk, mis on vajalik heterokromatiini moodustamiseks, seondub nii HDAC 4 ja 5-ga ning samuti SUV39H1 histooni metüültransferaasiga. Kogu kompleks töötab ühise eesmärgi nimel: HDAC deatsetüleerib histooni, et SUV39H1 saaks seda metüleerida ning HP1 seondub kromodomääni kaudu metüül-lüsiinile.

16. Histoonide deatsetülaaside kompleksid pärmis Rpd3 – peamine transkriptsiooni repressiooniks kasutatav HDAC. Laia spetsiifikaga, deatsetüleerib kõiki histoone. Hda1 – seotud transkriptsiooni repressiooniga, deatsetüleerib histoone H3 ja H2B, samuti vajalik histoonide deatsetüleerimiseks sub-telomeersetel HAST (Hda1-affected subtelomeric) aladel Hos1 ja Hos3 – vajalikud eeskätt ribosomaalset RNA-d kodeeriva piirkonna (rDNA) deatsetüleerimiseks. Hos2 – deatsetüleerib histoone geenide kodeerivatel aladel Sir2 – histoonide deatsetüleerimine telomeeridel, ainult H4 K16

17. Histoonide deatsetülaaside kompleksid imetajates Imetajate rakkudes on veidi suurem hulk erinevaid HDAC-e ning nad täidavad olulist rolli mitmete signaalide ülekannetes. Nad on olulised rakkude differentseerumisel, kus mitmete HDAC-idega seonduvad erinevad transkriptsiooni repressorid. Paljudel juhtudel reguleeritakse HDAC-ide aktiivsust läbi nende fosforüleerimiste ja rakusisese lokalisatsiooni. HDAC-ide inhibiitorid on kasutuses (ja katsetustes) vähiravimitena. HDAC-ide inhibiitorid

18. Histoonide atsetüleerimise-deatsetüleerimise tasakaal. Üldiselt on nii, et kui on vaja näiteks transkripsiooni aktiveerida, siis tuleb HAT-id õigesse kohta aktiivselt kohale tuua. Kui seda ei tehta, siis viib see histoonide deatsetüleerimiseni. Seega on histoonide “normaalne” olek deatsetüleeritud: kui pole öeldud teisiti, siis tuleb histoonid deatsetüleerida. Pärmis hoolitsevad mittespetsiifilise nn “globaalse” histoonide deatsetüleerimise eest põhiliselt Rpd3 ja Hda1. Imetajates on suhteliselt levinud ka teiste valkude atsetüleerimised-deatsetüleemised ning vähemalt mõned HDAC-id on olulised ka nende valkude deatsetüleerimiseks.

19. Histoonide metüül-transferaasid

20. Histooni lüsiinide metüül-transferaasid Lüsiine metüleerivad transferaasid on väga koht-spetsiifilised.

21. Histoonide metüül-transferaasid Histoonide metüleerimiste roll rakus on vastuoluline: see võib tähendada nii geenide aktiivset transkriptsiooni (näiteks H3 K4 metüleerimine) kui ka repressiooni (näiteks H3 K9 metüleerimine). Enamsti on tegu siiski represseeriva modifikatsiooniga. Lisaks võivad mono- di- ja trimetüleerimine omada erinevaid tähendusi (näiteks H3 K36 on trimetüleeritud transkriptsiooniliselt aktiivses kromatiinis, kuid sama koha monometüleerimine ei tähenda midagi). Samas pole seni leitud histoonide metüül-transferaase, mis tekitaks ainult mono-, di- või trimetülatsiooni. Ensüümid on küll konkreetse aminohappejäägi spetsiifilised, kuid võivad seal teha kõiki metüleerimise variante. Histoonidel on kokku teada 24 erinevat kohta, mille metüleerimine on tuvastatud. Kui arvestada nende saitide omavahelist kombinatoorikat ja samuti mono-, di- ja trimetüleerimise võimalust, siis kokkuvõtteks on puhtalt metüleerimistega võimalik tekitada 3 x 1011 erinevat histoonide mustrit.

22. Histoonide metüül-transferaasid Seega oleme me histoonide metüleerimiste koodi mõistmisest veel üsna kaugel. Praeguseks on juba teada, et lisaks kromodomäänile on ka teisi valgumotiive, mis võivad spetsiifiliselt seonduda metüleeritud histoonidega. Nende domäänide seostumise aktiivsus on ilmselt reguleeritud nii teiste valkude kui ka histoonide muude modifikatsioonidega.

23. Histoonide demetülaasid Neid esialgu vaid kaks ongi: LSD1 (lysine-specific demethylase 1) PAD4 (peptidyl arginine deiminase 4)