Patologia molecolare

1. Patologia molecolare Per dire che un gene candidato è responsabile di una patologia, bisogna trovare in esso mutazioni nei soggetti affetti. A che cosa ci si può trovare di fronte quando si sequenzia il DNA dei geni-malattia in soggetti affetti da una patologia genetica ?

2. Gene tipo D A B C E F ATG * D A B C E F mRNA AAAAAAA * ATG 5’UTR CDS 3’ UTR

3. Riarrangiamenti genici Delezioni A B E F Inserzioni B* D A C E F Inversioni D A C B E F Solitamente queste alterazioni determinano pesanti conseguenze a livello della proteina (completa inattivazione o produzione di molecole tronche). Ne risulta perdita di funzione del gene.

4. Mutazioni puntiformi Wild type M L K F K Y G V L N ATG TTG AAG TTC AAG TAT GGT GTG CTG AAC Missense M L K F KFG V R N ATG TTG AAG TTC AAG TTT GGT GTG CGG AAC Non sense M L K F K- ATG TTG AAG TTC AAG TAG GGT GTG CTG AAC Frame-shift M L K F K YK V C- ATG TTG AAG TTC AAG TAT AAG GTG TGC TGA

5. La corea di Huntington • Autosomica dominante, gene localizzato su una regione ristretta del cromosoma 4 mediante classica analisi di linkage. • Il sequenziamento del DNA dei pazienti non evidenzia nessuna delle mutazioni tradizionali • L’unica differenza identificata consisteva nella lunghezza di un particolare segmento genico, corrispondente ad uno degli esoni di un gene della regione critica.

6. La corea di Huntington Soggetto normale M L K Q Q Q Q Q Q Q Q Q QATG TTG AAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Q Q Q Q Q Q F K Y G V L N CAG CAG CAG CAG CAG CAG TTC AAG TAT GGT GTG CTG AAC Paziente M L K Q Q Q Q Q Q Q Q Q QATG TTG AAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q QCAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q QCAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG Q Q Q Q Q Q F K Y G V L N CAG CAG CAG CAG CAG CAG TTC AAG TAT GGT GTG CTG AAC

7. Meccanismo della malattia • La cornice di lettura non è alterata. • I livelli di proteina si mantengono costanti • L’espansione del tratto di triplette CAG all’interno della sequenza codificante determina la produzione di proteine caratterizzate da tratti di poliglutamina molto lunghi. • I tratti di poliglutamina sono tossici per i neuroni, perché formano aggregati nucleari che portano, con meccanismi ancora da chiarire, alla morte delle cellule.

8. Malattie da espansione di CAG nella sequenza codificante • Corea di Huntington • Malattia di Kennedy • Atassia spino-cerebellare 1 • Atassia spino-cerebellare 2 • Atassia spino-cerebellare 3 • Atassia spino-cerebellare 6 • Atassia spino-cerebellare 7 • Atrofia dentatorubro-pallidoluysiana

9. Distrofia miotonica Autosomica dominante, espansione di triplette CGG all’interno della regione 3’ non tradotta del gene codificante per una protein-chinasi. Ancora non si conosce il meccanismo con cui questa mutazione determina la patologia.

10. Altre patologie da espansione di sequenze ripetute instabili • Sindrome dell’X fragile, gene A (X linked recessiva, triplette CGG nel 5’ UTR del gene FRAXA, ridotta espressione) • Sindrome dell’X fragile, gene E (X linked recessiva, triplette CCG nel promotore del gene FRAXE, ridotta espressione) • Atassia di Friederiech (autosomica recessiva, triplette GAA nel I introne ridotta espressione) • Atassia spino-cerebellare 8 (dominante, triplette CTG in un RNA non tradotto, mecanismo ignoto) • Epilessia mioclonica giovanile (autosomica recessiva, ripetizione CCCCGCCCCGCG nel promotore, ridotta espressione)

11. Dominante o recessivo? lo strano caso di p53 • Inizialmente venne isolata come proto-oncogene, perché alcuni suoi mutanti funzionavano da oncogeni, con un’azione trasformante dominante • In seguito si è capito che in realtà è un gene oncosoppressore perché è il gene più frequentemente inattivato nei tumori (anche da virus oncògeni). • Come si spiega l’effetto dominante di alcuni mutanti puntiformi? • Effetto dominante negativo

12. Mutazioni caratteristiche delle patologie recessive • In genere le patologie recessive sono causate da mutazioni che determinano perdita di funzione del gene interessato (loss of function). Quando sono in eterozigosi, la quantità di proteina residua, prodotta dall’allele normale è sufficiente a mantenere un fenotipo normale. • Possono essere causate da tutti i tipi di mutazione conosciuti: • Riarrangiamenti genici • Mutazioni puntiformi (possono colpire la trascrizione, lo splicing, la traduzione o determinare la comparsa di codoni di stop precoci) • Espansione di sequenze ripetute

13. Ras Notch WT Proteolisi Mutante Nucleo Mutazioni caratteristiche delle patologie dominanti • La proteina continua a svolegere la sua funzione, ma lo fa in maniera eccessiva o non regolata. Le mutazioni alla base di questo effetto sono in genere mutazioni puntiformi missense o mutazioni troncanti che determinano la delezione di domini autoinibitori della proteina

14. Mutazioni caratteristiche delle patologie dominanti • La proteina acquisisce una nuova caratteristica, che non ha niente a che fare con il fisiologico meccanismo d’azione. Le mutazioni responsabili sono in genere di tipo puntiforme missense o troncanti. Tuttavia uno dei casi più tipici è quello della espansione di triplette CAG codificanti poliglutamina. • La proteina mutata interferisce con quella non mutata eliminandone la funzione (meccanismo dominante negativo). Questo si verifica di solito quando la funzione della proteina in questione dipende dalla formazione di multimeri. Mutazioni puntiformi missense o troncanti . Altro esempio è quello delle patologie del collagene.

15. Osteogenesi imperfetta

16. Omozigote Eterzigote Eterzigote normale compensato aploinsufficienza Attività 100% 50% 50% Fenotipo normale Fenotipo normale Fenotipo patologico Mutazioni caratteristiche delle patologie dominanti • Raramente può succedere che, nel caso di una mutazione inattivante di un allele, quello rimasto non sia sufficiente a compensare (fenomeno dell’aploinsufficienza). In questo caso comunque molto spesso gli omozigoti hanno un fenotipo molto più grave degli eterozigoti.

17. A volte mutazioni diverse a carico di uno stesso gene possono determinare fenotipi completamente diversi Gene PAX3 • Fattore trascrizionale che regola lo sviluppo dei melanociti • Le mutazioni con perdita di funzione determinano la sindrome di Waardenburg (difetti di pigmentazione cutanea + sordità) • Le mutazioni con acquisizione di funzione (traslocazione e produzione di nuovi fattori trascrizionali ibridi) sono oncogenesi (rabdomiosarcoma)

18. Ricordare sempre che tutti i fenotipi patologici possono essere pesantemente influenzati dalla contemporanea presenza di varianti di altri geni, detti geni modificatori. I geni modificatori sono alla base dei fenomeni di penetranza ed espressività variabile. Chinasi Funzione A P-A Fosfatasi