Patologia Molecolare

1. Patologia Molecolare

2. Patologia molecolare Cerca di spiegare perché un dato cambiamento genetico dia luogo ad un particolare fenotipo clinico

3. Patologia molecolare Ci richiede di elaborare l'effetto di una mutazione sulla quantità o sulla funzione del prodotto genico di spiegare perché il cambiamento è o non è patogeno per ogni particolare tipo cellulare, tessuto o stadio di sviluppo

4. Tipi di alterazioni sul DNA • DELEZIONI da 1 nt a più megabasi • INSERZIONI • MUTAZIONI DINAMICHE (unità ripetute in tandem che cambiano dimensione quando trasmesse alla prole) • SLITTAMENTI DEL MODULO DI LETTURA • SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI: • MUTAZIONI SINONIME (SILENTI) • MUTAZIONI MISSENSO: nel prodotto genico sostituzioni di un aa con un altro • MUTAZIONI NONSENSE: sostituiscono codone di un aa con codone di stop • MUTAZIONE NEI SITI DI SPLICING

5. MUTAZIONI NEI SITI DI SPLICING: Creano o distruggono segnali di splicing tra esoni e introni. Si verificano generalmente nei dinucleotidi essenzialmente invarianti GT e AG, localizzati all’inizio di un introne (sito donatore di splicing) o alla sua fine (sito accettore di splicing)

6. GT AG GT AG SPLICING mRNA MUTAZIONI CHE ALTERANO LO SPLICING Se la mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing, il processo di eliminazione degli introni non può avvenire normalmente

7. INCIDENZA DELLE DIVERSE MUTAZIONI NEL GENOMA UMANO

8. NOMENCLATURA PER DESCRIVERE L'EFFETTO DI UN ALLELE MUTATO • Allele Nullo o amorfo: un allele che non produce alcun prodotto • Ipomorfo: un allele che produce un ridotto quantità o attività di prodotto • Ipermorfo: un allele che produce un aumento di quantità o attività di prodotto • Neomorfo: un allele con una nuova attività o prodotto • Antimorfo: un allele la cui attività o prodotto antagonizza l'attività del prodotto normale.

9. CAMBIAMENTO FENOTIPICO MUTAZIONE • La mutazione di un gene potrebbe causare un cambiamento fenotipico in due modi: • Il prodotto potrebbe essere ridotto o non avere funzione (mutazioniloss of function - amorfo o ipomorfo); • Il prodotto potrebbe agire positivamente in modo anomalo (mutazionigain of function - ipermorfo o neomorfo)

10. Loss of function mutation

11. Loss of function mutations Avvengono quando mutazioni puntiformi in un gene producono gli stessi cambiamenti patologici di una delezione

12. Nella maggio parte dei casi fenotipi recessivi La maggior parte dei difetti congeniti del metabolismo sono recessivi Per alcuni prodotti genici il 50% del livello non è sufficiente per la funzione normale, e l’aploinsufficienza produce un fenotipo anomalo, che viene quindi ereditato in maniera dominante A volte un polipeptide mutato non-funzionante interferisce con la funzione dell’allele normale in un soggetto eterozigote, dando un effetto dominante negativo (allele antimorfo) Loss of function mutation

13. Per alcuni prodotti genici il 50% del livello non è sufficiente per la funzione normale, e l’aploinsufficienza produce un fenotipo anomalo, che viene quindi ereditato in maniera dominante Loss of function mutation

14. Mutationi loss of function nel gene PAX3 (Waardenburg s.)

15. Ciuffo di capelli bianchi o capelli brizzolati in età precoce, intorno ai 12 anni. SINDROME DI WAARDENBURG • SORDITÀ neurosensoriale (o deficit uditivo di vario livello) bilaterale • ALTERAZIONInella pigmentazione, sia dei capelli (albinismo parziale, in genere piebaldismo) che della pelle, • ANOMALIE nello sviluppo dei tessuti derivati dalla cresta neurale • LATERALIZZAZIONE del canto mediale Aumentato spazio tra gli angoli interni degli occhi (telecanto). Sopracciglia unite Attaccatura dei capelli frontale molto bassa Una delle caratteristiche più comuni è il diverso colore degli occhi (eterocromia), di solito uno marrone e l'altro blu. Il suo nome deriva da Peter Johannes Waardenburg, un oculista tedesco che per primo notò sintomi di ipoacusia in persone con occhi di colore differente. 4 tipi di WS associazione con altre anomalie WS I WS II non è presente telecanto WS III sono presenti malformazioni agli arti WS IV è presente megacolon (malattia di Hirschsprung)

16. Sindrome Gene Ereditarietà WS I PAX3 (fattore di trascrizione) AD 2q35 WS II MITF (fattore di trascrizione) AD 3p14.1-p12.3 WS III PAX3 (fattore di trascrizione) AD 2q35 WS IV EDNRB (recettore endotelina) AR 13q22 EDN3 (endotelina) AR 20q13.2-q13.3 SOX10 (fattore di trascrizione) AD 22q13

17. Mutationi in PAX3(locus cromosomico 2q35) causa WSI and WSIII Mutazioni causative in PAX3 includono sostituzioniaminoacidiche, frameshifts,mutazioni displicing, and in alcuni pazienti delezioni complete della sequenza PAX3. Tutte producono lo stesso risultato clinico: la perdita di funzione di PAX3

18. Only relatively few genes show haploinsufficiency

19. Perché relativamente pochi geni sono sensibili al dosaggio? A volte, se il prodotto genico è necessario in grandi quantità, la capacità totale di sintesi della cellula, anche a livelli massimi di trascrizione, può essere insufficiente se una sola copia del gene è presente Esempio: elastina Nei soggetti eterozigoti per una delezione o mutazione con perdita di funzione di elastina, per la maggior parte il tessuto elastico (cute, polmoni, vasi sanguigni) lavora normalmente, ma spesso l'aorta, un tessuto molto elastico, mostra un certo grado di restringimento appena sopra la cuore (stenosi aortica sopravalvolare), che può richiedere un intervento chirurgico

20. Modi di ridurre o abolire la funzione di un prodotto genico

21. EMOGLOBINOPATIE Tre gruppi principali 1. Talassemiecausate da inadeguate quantità di catene α o β Gli alleli sono classificati in quelli che non producono (a0, β0) e quelli che producono meno quantità di proteina (a+, β+)

22. a2 a1 Talassemie normale La perdita di geni a-globinici porta a forme di a-talassemia di differente severità a2-talassemia (portatore silente) a1-talassemia (anemia non significativa) Hb H disease (anemia da lieve a severa) Idrope fetale (morte fetale o in epoca neonatale)

24. Modi di ridurre o abolire la funzione di un prodotto genico

25. Distrofia Muscolare di Duchenne E’ una forma di distrofia muscolare trasmessa come carattere legato all’X che determina degenerazione progressiva delle fibre muscolari E’ dovuta all’assenza di una proteina detta Distrofina L’assenza di questa proteina determina una serie di eventi che portano a degenerazione del tessuto muscolare, che viene sostituito da tessuto fibroso e adiposo. Conseguenza clinica: progressiva perdita di forza muscolare con conseguente progressiva perdita delle abilità motorie Deletions in the dystrophin (DMD) gene

26. Delezioni nel gene della distrofina (DMD) Dimensione della delezione Frameshifproduce la distrofia muscolare di Duchenne letale, in cui non viene prodotta distrofina Nonframeshifcausa la forma più lieve di Becker, in cui la distrofina è presente, ma anomala

27. MUTAZIONI CHE CAMBIANO LA FASE DI LETTURA (FRAMESHIFT) • Qualunque inserzione o delezione di un numero di basi che non sia multiplo di 3 in un esone comporta necessariamente una modifica della fase di lettura. Tale situazione esita, prima o poi, nella comparsa di un codone nonsenso prematuro. • Se l’alterazione ha luogo all’estremità 3’ della sequenza codificante, questa può anche essere allungata fino ad un codone nonsenso neoformato nella regione 3’ non codificante del messaggero.

28. GT AG GT AG SPLICING mRNA MUTAZIONI CHE ALTERANO LO SPLICING Se la mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing, il processo di eliminazione degli introni non può avvenire normalmente

29. SD SA In generale, l’esone localizzato a monte di un sito donatore mutato, o a valle di un sito accettore mutato, viene eliminato.

30. RITENZIONE DI UN INTRONE SD SA

31. SD SA ATTIVAZIONE DI UN SITO CRIPTICO DI SPLICING SPLICE DONOR CRIPTICO CT GT AG

32. A volte un polipeptide mutato non-funzionante interferisce con la funzione dell’allele normale in un soggetto eterozigote, dando un effetto dominante negativo (allele antimorfo) Loss of function mutation

33. Mutazioni di proteine che funzionano come dimeri o multimeri a volte producono effetti dominanti negativi Un effetto dominante negativo si verifica quando un polipeptide mutante non solo perde la propria funzione, ma interferisce in un eterozigote anche con il prodotto dell’allele normale Mutazioni dominanti negative causano effetti più gravi rispetto a delezioni o mutazioni non-senso nello stesso gene. Le proteine strutturali che contribuiscono a strutture multimeriche sono vulnerabili agli effetti dominanti negativi Esempio: Collageni

34. Struttura del collageno • Unità costitutiva è il tropocollageno( 300 kDa): formato dall’unione di 3 catene polipeptidiche avvolte in una tripla elica destrorsa molto stretta (elica del collagene) di 300 x 1.5 nm. • Struttura primaria generale di una singola catena (c.a 103 residui): Gly-X-Y330 circa 100 residui X sono Pro/Lys e 100 residui Y sono 4-OH-Pro/5-OH-Lys • Struttura secondaria di una singola catena: elica sinistrorsa (struttura ordinata né  né ) stabilizzata da ponti H; 3 residui per giro

35. Y Y Il collagene di tipo I è un eterotrimero, composto da due catene alpha1 e una catena alpha2, ciascuna caratterizzata dalla ripetizione della tripletta (Gly-X-Y)338, dove X è spesso prolina e Y idrossiprolina. Il ripiegamento ottimale delle catene a formare un’elica richiede che il terzo aminoacido nella tripletta sia glicina, dal momento che la piccola dimensione della sua catena laterale può adattarsi ad occupare l’interno della tripla elica senza generare distorsioni.

36. Segue struttura… • 3 eliche sinistrorse sono avvolte una sull’altra a formare un’elica destrorsa (avvolta in senso orario), l’unità di tropocollageno,stabilizzata da legami deboli (ponti H) e anche covalenti molto resistente alla trazione, ma non elastica • La polimerizzazione spontanea (extracellulare!) delle unità di tropocollageno forma le fibrille collagene. • Periodicità allineamento genera striature di 64 nm.

37. Tipi di collageno (almeno 12 tipi)

38. Collageni fibrillari, le principali proteine strutturali del tessuto connettivo, sono costruite in triple eliche di catene polipeptidiche, a volteomotrimeri,a volteeterotrimeri, che vengono assemblati reticolati strettamente imballati a formare fibrille rigide

39. Riepilogo della sintesi del collageno

40. Un polipeptide che forma complessi con catene normali, ma poi distruggendo la tripla elica può ridurre la produzione del collagene funzionali ben al di sotto del 50%

41. Mutazioni in questi geni producono solitamente l'osteogenesi imperfetta (OI)

42. Osteogenesi imperfetta Deformità ossee, deficit accrescimento, fratture multiple spontanee, sordità, dentinogenesi difettosa.

43. Mutazioni in questi geni producono solitamente l'osteogenesi imperfetta (OI) Mutazioni frameshift e nonsense producono OI di tipo 1, la forma più lieve, mentre sostituzioni aminoacidiche nelle unità ripetute Gly-XY si osservano nei tipi più gravi di OI: II, III e IV.

44. Mild OI: frameshifts and nonsense mutations Severe OI: amino acid substitutions in the Gly-X-Y repeated

45. osteogenesi imperfetta

46. Skipping dell'esone 6 (di COL1A1 o COL1A2) ha un effetto molto diverso Viene perduto il sito per la scissione del propeptide N-terminale e il collagene anomalo prodotto provoca la sindrome di Ehlers Danlos tipo VII (lassità della pelle e delle articolazioni)

47. Ehlers-Danlos syndrome

49. Mutazioni del canale del K, la subunità KvLQT1 sono stati identificati come responsabili di entrambe le patologie: Romano-Ward (RW) e Jervell e Lange-Nielsen (JLN) sindromi del QT lungo Un altro esempio di strutture multimeriche che sono soggette a effetto dominante negativo: canali ionici delle membrane cellulari

50. Mutazioni Loss of function (2) • L'effetto fenotipico dipende dal livello di prodotto del gene residuo • Molte sostituzioni di amminoacidi hanno poco o nessun effetto, mentre alcune mutazioni aboliscono totalmente la funzione • Una mutazione può essere presente in una o entrambe le copie di un gene Quando entrambi le omologhi sono colpiti, possono essere influenzati in maniera disuguale - le persone con condizioni autosomiche recessive sono spesso eterozigoti composti, con due differenti mutazioni Se entrambe le mutazioni causano la perdita di funzione, ma in misura diversa, l'allele meno grave detterà il livello di funzione residuale