Gli alunni: Marta Amato IIB Luisa Bojancow IIF Gennaro Salerno IIF Maria Mosella IID

1. Gli alunni: Marta Amato IIB Luisa Bojancow IIF Gennaro Salerno IIF Maria Mosella IID Emanuele Pirozzi IID presenteranno il percorso del progetto, fino ai risultati conclusivi dell’indagine, con particolare attenzione alle metodiche biotecnologiche impiegate. PROGETTO BIOTECNOLOGIE A SCUOLA – EUREKA 5 Diversità Genetica e Uguaglianza Umana A cura di: Dr. Luigi Ippolito, D.ssa Federica DeSimone, Prof.ssa Francesca Uletto, Prof. Vincenzo De Simone, Prof.ssa Monica Piedimonte Gli alunni: Marta Amato IIB Luisa Bojancow IIF Gennaro Salerno IIF Maria Mosella IID Emanuele Pirozzi IID presenteranno il percorso del progetto, fino ai risultati conclusivi dell’indagine, con particolare attenzione alle metodiche biotecnologiche impiegate.

2. potenzialità e limiti della genetica forense

3. Chi è il colpevole ? Obiettivi del nostro lavoro Utilizzare le procedure in uso presso i laboratori della scientifica per attribuire l’appartenenza di un campione di DNA ad un determinato individuo

4. le fasi del nostro lavoro • Riconoscere sul DNA le sequenze geniche, caratteristiche di ciascun individuo, che ne consentano l’identificazione (LOCI) • Individuarne i segmenti terminali (PRIMERS) per procedere all’amplificazione (duplicazione) • Prelevare il nostro DNA • Amplificarlo per disporre della giusta quantità di copie da analizzare • Sottoporre i campioni ad elettroforesi per riconoscere le corrispondenze fra le sequenze dei reperti con quelle del sospettato • PROCEDERE ALL’INCRIMINAZIONE !

5. Individuazione delle sequenze geniche caratteristiche che consentano l’identificazione del DNA • Gli esseri umani dispongono di 23 coppie di cromosomi omologhi, uno di origine paterna, l’altro di origine materna • Su ciascun membro della coppia sono presenti gli stessi Geni ma non necessariamente le stesse varianti (Alleli) nei medesimi Loci Allele per il gruppo sanguigno A Locus per il gene Gruppo sanguigno Cromosomi omologhi Allele per il gruppo sanguigno B

6. Il corredo cromosomico umano

7. Distribuzione di sequenze nel genoma umano Genoma Umano 3200 Mb Geni e sequenze correlate DNA intergenico 1200 Mb 2000 Mb Geni Sequenze Ripetizioni Altre regioni 48 Mb correlate intersperse intergeniche 1152 Mb 1400 Mb 600 Mb Pseudogeni LINE Microsatelliti 640 Mb 90 Mb Frammenti genici SINE Varie 420 Mb 510 Mb Introni, UTR Elementi LTR 250 Mb Trasposoni DNA 90 Mb

8. Polimorfismi e microsatelliti • L’evoluzione ha accumulato nel tempo diverse mutazioni all’interno dei singoli loci dando luogo a polimorfismi (varianti alleliche presenti in almeno l’1% della popolazione) • Nel DNA polimorfico sono presenti elementi genetici ripetitivi che in genere non codificano per un polipeptide • Gli elementi genetici ripetitivi includono i  microsatelliti o STR ( short tandem repeats cioè ripetizioni brevi in tandem) costituiti da numerose ripetizioni di brevi sequenze di coppie di basi azotate dalle 5 alle 50 volte sullo stesso cromosoma. 5’-TATTTATTTATTTATTTATTTATTTATT-3’ 5’- GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-3’

9. Analizzando i polimorfismi in maniera approfondita, è possibile identificare un essere umano con un alto grado di affidamento. • Questo metodo fornisce il PROFILO GENETICO (IMPRONTE DIGITALI DI DNA) e fornisce un importante strumento nelle indagini investigative. • Attualmente, l'FBI utilizza tredici diversi loci polimorfici per ottenere l’impronta digitale del DNA. • l'analisi dei polimorfismi può aiutare a provare o smentire la paternità nei casi in cui è contestata la responsabilità di un bambino.

10. Abbiamo individuato 15 loci STR

11. Le nostre attività Laboratorio 1 - Bioinformatica Progettazione dei primers Ricerca al computer delle sequenze d’innesco (PRIMERS) per l’amplificazione dei loci individuati per l’identificazione del DNA Invio delle sequenze al servizio CEINGE per richiedere la sintesi dei primers Calcolo delle temperature di lavoro idonee per consentire il legame primer- DNA stampo

12. laboratorio 2 Prelievo ed estrazione del DNA

13. Prelievo ed estrazione del DNA • Il nostro DNA è stato : • prelevato dalle cellule della mucosa orale • estratto da esse provocandone la lisi • privato delle proteine associate • lasciato precipitare in etanolo freddo.

15. laboratorio3 • Elettroforesi del NOSTRO DNA per controllare la riuscita dell’estrazione e le dimensioni • Assemblaggio delle reazioni di PCR

16. Elettroforesi su gel

17. Elettroforesi su gel Abbiamo caricato i nostri campioni di DNA nei pozzetti e li abbiamo sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio per separarli e distinguerli. Abbiamo letto al transilluminatore UV i nostri risultati

18. Amplificazione del DNA estratto col metodo della PCR Il termociclatore, in seguito a cicli successivi di riscaldamento e raffreddamento,In presenza di DNA, DNA polimerasi termostabile , PRIMERS e deossinucleotidi,duplica il segmento milioni di volte

19. Laboratorio 4 - Bioinformatica Dopo aver appreso le metodologie biotecnologiche alla base della genetica forense, per ottenere risultati più simili a quelli reali , anziché usare i campioni del nostro DNA , separati con ELETTROFORESI SU GEL e soggetti a qualche imprecisione legata all’inesperienza, abbiamo utilizzato CAMPIONI REALI (anonimi) , provenienti dal servizio CEINGE dell’Università Federico II di Napoli, analizzati con ELETTROFORESI CAPILLARE.

20. Mediante l’impiego di fluorocromi (molecole in grado di dare fluorescenza), la migrazione delle molecole è registrata da un rilevatore,analizzata e visualizzata in un unico grafico caratterizzato da una successione di picchi di colori diversi, corrispondenti alle emissioni fluorescenti dei vari fluorocromi. L’esito di questo procedimento è un diagramma colorato(un elettroferogramma)

21. Per entrambi i gruppi di campioni è stato usato un Kit commerciale a 15 loci STR

22. Pannelli di marcatori fluorescenti

23. picchi di fluorescenza degli alleli di ciascun locus di riferimento picchi di fluorescenza degli alleli di ciascun locus del campione

24. Abbiamo analizzato gli elettroferogrammi dei 18 campioni • Li abbiamo confrontati con quelli di riferimento • Abbiamo individuato i diversi alleli di ciascun locus prescelto • Li abbiamo registrati in una tabella

25. Lettura e analisi degli elettroferogrammi

26. I nostri risultati IL SOGGETTO NUMERO 16 È IL COLPEVOLE ! Il profilo del suo DNA è identico a quello prelevato sulla scena del crimine (n° 2) IL SOGGETTO NUMERO 17 È IL PADRE DEL NUMERO 18 ! Il profilo del DNA di quest’ultimo corrisponde per il 50% degli alleli a quello del padre.

27. conclusioni • Il campo d’azione della genetica forense oggi è quello di identificare l’appartenenza del DNA ad un determinato individuo tracciandone il profilo ( DNA fingerprinting) e di individuare in esso relazioni parentali • Da oltre 10 anni si sta affermando la tendenza a correlare il comportamento umano ad alcune caratteristiche genetiche ,così da condurre ad una diversa determinazione della pena

28. ma….. Avere predisposizioni genetiche non è essere determinato geneticamente PREDISPOSIZIONE GENETICA DETERMINISMO GENETICO Interazione e regolazione genica mutazioni ambiente Libero arbitrio