Alapismeretek

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 1. Előadás Alapismeretek

3. A kurzus célja • Elméleti háttérismeretek komplex szövetkultúrák előállításához

4. A kurzus tartalma

5. Mi a„tissue engineering”? • „Tissue engineering”eredetileg a biológiai anyagtudományok és a mérnöki tudományok egyik mellékágaként jött létre, de mivel az utóbbi időben mind jelentősége, mind művelőinek száma megnőtt, ma már önálló tudományágnak számít. • A „tissue engineering”célja specifikus szövetek, illetve akár teljes szervek regenerálása valamint újra-előállítása, a biológiai funkciók megtartása vagy helyreállítása (csont, porc, ér, lép, bőr, stb.) mellett. • Ennek érdekében különböző technikák kombinációit használja: sejttenyésztés, bioanyagok szintézise, biokémiai és biofizikai módszerek.

6. A „tissue engineering” alapjai Biopszia vagy reszekció útján nyert sejtek Beültetés Biopszia Graft előállítása 3D tenyésztés („scaffold”-on vagy anélkül) Felszaporodott sejtkultúra Monolayer sejtkultúra

7. 2D szövetkultúra Adherens Nem adherens Tripszin Tripszin nélkül Szuszpendálás Pelleting Reszuszpendálás Sejtek kirakása

8. 3D szövetkultúrák Elégtelen diffúzió Tápanyagok és oxigén diffúziója Apoptotikus sejthalál Másodlagos nekrózis Egészséges szövet Nekrotikus szövet

9. Szövetek előállítása In vitro In vivo Vérsejtregeneráció(őssejtproliferációés differenciáció stimulálása) Sejtinjektálássérült szövetekbe(szívizomsejtek) Nagy sérülések regenerációja(biológiailagabszorbeálható„scaffold”-oknövekedési faktorokkal illetve nélkül) • Szöveti regeneráció (szövet proliferáció és regenerációmesterséges „scaffold”-on) • Bio-mesterségesszervek (máj, bőr, hasnyálmirigy)

10. Bioreaktor • Nekrózis elkerülésére Sav Habzás- gátló Bázis Szubsztrát Kevertetett bioreaktor Ipari bioreaktor Perisztaltikus pumpák Hab Fűtőszál T Szabályozó egység pH Pumpa Bemenő víz pO2 Ellennyomás szelep Biztonsági szelep Kimenő víz Q szelep Elektromágneses szelep hűtéshez Levegő Q Motor

11. Sejt- és szövetpótló terápia fő alkalmazási lehetőségei • Stroke • Traumásagysérülés • Alzheimer kór • Parkinson kór • Foghiány • Sebgyógyulás • Csontvelő transzplantáció • Gerincvelő sérülés • Oszteoarthritis • Rheumatoid arthritis • Kopaszság • Vakság • Süketség • Miokardiálisinfarktus • Muszkuláris disztrófia • Diabétesz • Multisite daganat • Amiotrófiás laterális szklerózis

12. A „tissue engineering” során használt sejtek • Őssejtek • Embrionális • Köldökzsinórvér • Csontvelő- vagy zsírszövet-eredetű • Felnőtt, szövetspecifikus • Érett, differenciálódottsejtek • Szövetspecifikus

13. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 2. Előadás Őssejtek(1)

14. Őssejtek • Totipotens • Pluripotens • Multipotens

15. Őssejt típusok Megtermékenyített petesejt 8 sejtes embrió Blasztociszta Tenyésztett őssejtek Idegsejtek Vérsejtek Totipotens Pluripotens Agy Idegsejtek Csontvelő Vérsejtek Multipotens Multipotens

16. Az őssejt osztódásának típusaiI. Őssejt Önmegújítás Aszimmetrikus osztódás, differenciáció Önmegújító leánysejt Leánysejt Szimmetrikus osztódás Szimmetrikus, osztódás, differenciáció

17. Az őssejt osztódásának típusaiII. Proliferációs képesség Differenciációs képesség Aszimmetrikus osztódás Sejtszám megsokszorozódás Progenitor sejteken át történő differenciáció Őssejt Véglegesen differenciálódott sejtek Proliferálódó szakasz

18. Őssejt források • Felnőtt (szomatikus) őssejtek (AdultStemCells, ASC) • Felnőtt multipotensőssejtek • Embrionális őssejtek (ESC)

19. Epiblaszt őssejtek (EpiSC) I. • Az epiblaszt olyan szövet, amely az embrionális őssejtek kialakulását követő későbbi fejlődési szakasz során jön létre. Kialakulása az embrió beágyazódása után történik.

20. Epiblaszt őssejtek (EpiSC)II. Embrionális ivarsejtek (EG) Extraembrionális endoderma(XEN) sejtek Trofoblaszt őssejtek (TS) Embrionális őssejtek (ESC) Epiblaszt őssejtek (EpiSC) IPS sejtek • Szomatikus sejtvonalak • Endoderma • Mezoderma • Ektoderma Primitív endoderma Trofektoderma (TE) Epiblaszt Dedifferenciáció Újraprogramozás Megtermékenyítés Primordiális ivarsejtek(GSC) Szedercsíra Késői blasztociszta

21. A multipotens felnőtt szomatikus őssejtek lokalizációja Korábban azonosított: Agy A közelmúltban gyakorlatilag minden szövetben mutattak ki őssejteket Bőr Csontvelő

22. Felnőtt (szomatikus) őssejtek(ASC) • A mikrokörnyezetet, aholaz őssejtek elhelyezkednek, őssejt„niche”-nek nevezzük ASC:

23. A felnőtt őssejt niche • Mikrokörnyezetként leírt őssejt niche-k:

24. Csontvelői őssejtek(MSCs) • Hemopoetikusőssejtek • Mezenchimálisőssejtek • Csontvelői stróma őssejtek • Endotél progenitorsejtek

25. Hemopoetikus őssejtek (HSC) I. • ThyloLin-Sca-1+ • CD4 és Mac-1 alapján 3 populáció különíthető el, és csak a Lin-Mac-1-CD4-populáció tartalmaz nagyszámútartósan újraképződőhemopoetikus őssejtet • c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2: hosszú távú repopulációs képesség • c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2+: rövid távú repopulációs képesség • c-kit+ThyloLin-(Flk-2-)Sca-1+: egérben hosszú távú repopulációs képesség

26. Hemopoetikus őssejtek (HSC)II. • Humán mintákban a CD34 antigén (funkciója nem ismert) expresszálódik • További markerek: CD38, CDE90 ésCD133 • Thy+CD34+ hosszú távú kultúrák mieloid és limfoid sejtvonalakat egyaránt generálnak • Thy-CD34+ nincsenek mieloid és limfoid sejtvonalakat egyaránt generáló hosszú távú kultúrák

27. Hemopoetikus őssejtek(HSC)III. Multipotenshemopoetikus őssejt (Hemocitoblaszt) Humán hemopoézis Közös mieloidprogenitor Közös limfoidprogenitor Mieloblaszt Proeritroblaszt (Pronormblaszt) Limfoblaszt Megakarioblaszt B. promielocita N. promielocita E. promielocita Monoblaszt Basofileritroblaszt Promegakarioblaszt Prolimfocita Polikromatikuseritroblaszt B. mielocita N. mielocita E. mielocita Promonocita Ortokromatikus eritroblaszt(Normoblaszt) B. metamielocita N. metamielocita E. metamielocita Kis limfocita Megakariocita Természetes ölősejt Polikromatikus eritrocita(Retikulocita) B. band N. band E. band T limfocita B limfocita Monocita Trombociták Eritrocita Basofil Neutrofil Eozinofil Hízósejt Mieloid dendritikussejt Limfoid dendritikus sejt Makrofág Plazmasejt

28. Mezenchimálisőssejtek(MSC)I. • Nincsenek hemopoetikus markereik(CD2, CD3, CD4, CD8, Mac-1/CD11b, CD14, CD15, CD19, CD20, B220, CD45, Thy1 és mieloperoxidáz) • Expresszió: LDL receptor, alkalikusfoszfatáz, simaizom aktin, IV-es típusú kollagén, laminin, VII-es faktor, MUC18, CD29, CD44, CD49A-F, CD51, CD73, CD105, CD106, CD166+

29. Mezenchimális őssejtek (MSC) II. • MSC-kcsontvelőből közvetlenül izolálhatóak NGFR (CD271), SSEA-1, SSEA-4, CD140b , CD340 (HER-2), CD349 (Frizzled-9)expresszió alapján • Tisztítás: CD29+, CD44+, CD73+, CD105+, CD106+, CD166+, valamint a hemopoetikus receptorok hiánya alapján

30. Endotél progenitor sejtek (EPC) • Felnőtt EPC-k CD34+vagy Flk-1+ (VEFR-2) • További markereik: CD31, Tie2 és E-szelektin, eNOS, LDLR, VEGFR-1,-2,

31. Csontvelői progenitor sejtek • HSC és EPC sejtvonalak hasonló temporálisés spatiálisfejlődést követnek • HSC és EPC közös markerei: VEGFR-2 (Flk-1), SCL/Tal1, Runx1 • Hemangioblaszt fenntartása

32. Szövetvonalak ontogenezise a csontvelőben Hemangioblaszt (Flk-1+, VEcadherin+, CD45-) Mezo-Angioblaszt HSC Oszteoblasztok MSC EPC Strómasejtek Periciták SMC Limfoid progenitorok Mieloid progenitorok Monociták EC T-sejtvonal B-sejtvonal

33. A csontvelői őssejtek funkcionálisegymásrautaltsága Mátrix proteinek, adhéziós molekulák, citokinek sorát expresszálja HSC MSC EPC