ZESPÓŁ PRACOWNI BADAWCZO-WDROŻENIOWYCH W LBG KOSTRZYCA

1. ZESPÓŁ PRACOWNI BADAWCZO-WDROŻENIOWYCH W LBG KOSTRZYCA PROPOZYCJE I REALIZACJA ZADAŃ mgr Małgorzata Pałucka Spotkanie Regionalnych Genetyków 24-25.04.2007 r.

2. NOWY SCHEMAT ORGANIZACYJNY LBG KOSTRZYCA Zastępca Dyrektora LBG Kierownik Zespołu Pracowni Badawczo-Wdrożeniowych Pracownia Kriokonserwacji Pracownia Analizy DNA (zatrudnienie 2 osoby) (zatrudnienie 2 osoby)

3. LOKALIZACJA PRACOWNI BADAWCZO-WDROŻENIOWYCH W BLOKU LABOTARORYJNYM PracowniaKriokonserwacji Pracownia Analizy DNA

4. DZIAŁALNOŚĆ PRACOWNI KRIOKONSERWACJI W 2006/2007 r. • Rozpoczęcie badań nad zamrażaniem osi zarodkowych dębów rodzimych w ciekłym azocie. • Rozpoczęcie badań nad zamrażaniem plumuli izolowanych z osi zarodkowych w ciekłym azocie.

5. PRACOWNIA KRIOKONSERWACJI • Opiekunem naukowym jest dr Paweł Chmielarz z Instytutu Dendrologii PAN w Kórniku. • Pracownia realizuje program pn.: „Zachowanie zasobów genowych zagrożonych i ginących gatunków metodami kriogenicznymi w Leśnym Banku Genów Kostrzyca”. • Program przewidziano na lata 2005-2010.

6. PRACOWNIA KRIOKONSERWACJI • Główny cel badań to opracowanie i wdrożenie metod bezpiecznego zachowania w ciekłym azocie zasobów genowych gatunków: • Quercus robur L., • Fagus sylvatica L., • Abies alba Mill, • Taxus baccata L.

7. PIERWSZA DOSTAWA LN2 (15.03.06 r.) Wybór dostawcy ciekłego azotu oraz podpisanie umowy na kupno i dostawę ciekłego azotu do LBG Kostrzyca

8. WYPOSAŻENIE PRACOWNI KRIOKONSERWACJI Zbiorniki do przechowania próbek w LN2. Fitotron – oddzielne pomieszczenie do hodowli tkanki roślinnej in vitro. Szafa fitotronowa. System szybkiego zamrażania w LN2.

9. Rozpoczęto badania nad kriokonserwacją osi zarodkowych dębów (kat. recalcitrant) - traktowanie osi zarodkowych krioprotektantami -krioprotekcja (1) • Krioprotektanty zabezpieczają komórki przed tworzeniem się wewnątrzkomórkowego lodu. • Sterylizacja osi zarodkowych w 10% Clorox`ie.

10. Stosowane krioprotektanty • sacharoza (0,5; 0,75; 1,0; 2,0; 3,0 i 5, 0 M), • gliceryna (1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 5, 0 M), stosowana również jako kolejny krioprotektant po sacharozie, • PVS-1 (30% gliceryna, 15% glikol etylenowy, 15% DMSO-dwumetylowy tlenek siarki; 0,4 M sacharoza), • PVS -2 (25% gliceryna, 15% glikol etylenowy; 12,5% DMSO; 0,4 M sacharoza, 3% glikol polietylenowy).

11. Podsuszanie (2) i zamrażanie (3) osi zarodkowych W LBG skonstruowano: • System podsuszania osi zarodkowych w gazowym azocie (zapewnia szybkie podsuszenie osi w kontrolowanych warunkach). • System szybkiego mrożenia osi w –210°C (zapewnia wysokie tempo mrożenia osi zarodkowych).

12. Podsuszanie osi zarodkowych temperaturze 25°C • podsuszanie w czasie 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 h • badano wpływ podsuszenia osi przed lub po krioprotekcji

13. Szybkie zamrażanie osi w temperaturze –210oC Azot w ciekłym stanie skupienia –196oC Osie zarodkowe Azot w stałym stanie skupienia –210oC Hodowla in vitro

14. Określanie żywotności osi zarodkowych in vitro (Q. robur) (Q. robur) (Q. kelloggii (Q. robur) Korzeń Pęd Korzeń + pęd 1. Korzeń = K+(K&P) 2. Pęd = P+(P&K) 3. Kalus & oś powiększająca się. PRZEŻYCIE (1+2+3) (Q. kelloggii) (Q. robur) (Q. robur) Wzrost kalusa lub powiększanie się osi Martwa oś

15. Podstawowe cele badań : • nowe metody sterylizacji osi (toksyczny dla ludzi chlorek rtęci zastąpiono bezpiecznym Clorox`em), badano metodę wstępnego przechowania osi po izolacji z żołędzi przez 18 h oraz możliwości neutralizacji związków fenolowych uwalnianych z ran po usuniętych liścieniach zarodka do pożywki, • wpływ krioprotekcji - traktowania osi zarodkowych krioprotektantami (sacharoza, gliceryna, PVS-1 i PVS-2) oraz czasu podsuszenia osi na ich żywotność (przeżywalność po 2 tygodniach hodowli in vitro), • wpływ zamrażania osi zarodkowych w ciekłym azocie po krioprotekcji i podsuszeniu, na ich żywotność (przeżywalność po 2 tygodniach hodowli in vitro).

16. Wybrane wyniki badań - traktowanie osi kwasem askorbinowym (eliminacja fenoli) Stężenia kwasu askorbinowego: A - 10% B - 50% C - 100% D - 1,0 M

17. IZOLACJA OSI KRIOP. PVS-1 0,5 h KRIOP. PVS-1 1,0h KRIOP. PVS-1 1,5 h KRIOP. PVS-2 0,5 h KRIOP. PVS-2 1,0 h KRIOP. PVS-2 1,5 h Podsu. 3,5 h (A1) Podsu. 3,5 h (A3) Podsu. 3,5 h (A5) Podsu. 3,5 h (B1) Podsu. 3,5 h (B3) Podsu. 3,5 h (B5) In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro ZAMR. -210°C (A2) ZAMR. -210°C (A4) ZAMR. -210°C (A6) ZAMR. -210°C (B2) ZAMR. -210°C (B4) ZAMR. -210°C (B6) In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro In vitro Traktowanie osi zarodkowych krioprotektantami, podsuszenie oraz zamrożenie osi w ciekłym azocie PVS-1 PVS-2

18. Podsumowanie • Stwierdzono duże zróżnicowanie masy indywidualnych osi zarodkowych pochodzących z żołędzi z poszczególnych drzew (od 0,05 do 0,18 g), • Traktowanie osi zarodkowych kwasem askrobinowym przez 1 h zwiększało liczbę osi zarodkowych wykazujących wzrost pędu in vitro, • Otrzymano porównywalną przeżywalność osi po wstępnym przechowaniu osi przez 18 h na wilgotnej bibule w szalce Petri`ego (5°C) z przeżywalnością osi po wstępnym przechowaniu w 0,5 M roztworze sacharozy (5°C),

19. Podsumowanie c.d. • Dwukrotna (2 x 10 min) sterylizacja osi w 10% Clorox`ie zmniejszyła liczbę zakażeń w pożywce w przypadku stosowania wysokich stężeń krioprotektantów, • Krioprotekcja przed podsuszeniem osi zapewniła wyższą przeżywalność osi zamrażanych w ciekłym azocie w porównaniu z krioprotekcją przeprowadzoną po podsuszeniu, • Podsuszenie osi (nawet do 7 h), z wyłączeniem krioprotekcji, nie zabezpieczyło komórek osi przed ujemnymi skutkami temperatury -210°C.

20. Podsumowanie c.d. • Otrzymano żywą tkankę osi zarodkowej (po 1h krioprotekcji w 1, 0 M roztworze sacharozy, 5, 5 h podsuszeniu osi i szybkim zamrożeniu w temperaturze -210°C), • Przy stosowaniu krioprotektantów przez dłuższe okresy czasu (> 1 h) lub w wyższych stężeniach (> 2,0 M) czas podsuszenia osi zarodkowych gazowym azocie powinien być krótszy (< 4 h),

21. Podsumowanie c.d. • Zastosowanie krioprotektantów PVS-1 oraz PVS-2 wraz z ok. 4-5 h podsuszeniem osi zarodkowych po krioprotekcji, zapewniało przeżywalność osi zarodkowych po rozmrożeniu z temperatury -210°C na poziomie ok. 40% (dotyczy to osi izolowanych z żołędzi świeżych, przechowywanych po zbiorze do kilku tygodni).

22. Podsumowanie c.d. Z innych prac, jakie wykonano w ramach realizacji tematu: • założenie sterylnych kultur in vitro pędów dębu szypułkowego (ukorzenione sadzonki w probówkach). Pąki sterylnych pędów będą wykorzystane do badań kriogenicznych w roku 2007 r. • Przechowywanie żołędzi dębu szypułkowego zebranych w 2006 r. (do wykorzystania w 2007 r.) oraz orzeszków buka zwyczajnego zebranych w 2006 r. (do wykorzystania w 2008 r.)

23. Izolacja plumul z osi zarodkowych, 2007 r. Plumula

24. Kriokonserwacja plumul Różne warianty doświadczenia Plumule odsączone po sterylizacji

25. Rozwijająca się plumula in vitro po przemrożeniu w LN 1 mm

26. Pracownia Kriokonserwacji w 2007 r. • Kontynuacja badań nad kriokonserwacją osi zarodkowych oraz plumul Q.robur L. • Rozpoczęcie badań nad kriokonserwacją osi zarodkowych F.sylvatica L.

27. Orzeszki F.sylvatica L., do badań nad kriokonserwacją w 2007 r.

28. Nasiona Q.robur L., do badań nad kriokonserwacją w 2007 r.

29. Pracownia Analizy DNA Założenia programowe

30. PRACOWNIA ANALIZY DNA • Opiekunem naukowym pracowni jest prof. dr hab. Jarosław Burczyk z Zakładu Genetyki Uniwersytetu Kazimierza Wielkiego w Bydgoszczy. • Stałymi ekspertami są: • dr Justyna Nowakowska, IBL w Warszawie, • prof. dr hab. Andrzej Lewandowski, ID PAN w Kórniku.

31. PRACOWNIA ANALIZY DNA • Pracownia uczestniczy w realizacji programu badawczego pt.” Opracowanie i wdrożenie do praktyki leśnej metod identyfikacji i wczesnej oceny leśnego materiału rozmnożeniowego w oparciu o markery molekularne”. • Program przewidziano na lata 2006-2009. • Program realizują: • UKW w Bydgoszczy, • IBL w Warszawie, • ID PAN w Kórniku

32. PRACOWNIA ANALIZY DNAPROPOZYCJE PROGRAMOWE • Identyfikacja genetyczna drzew matecznych gromadzonych w LBG Kostrzyca (lata 2007-2012). • Zmienność populacyjna jodły pospolitej pochodzeń sudeckich z Rudaw dla potrzeb restytucji gatunku (2007-2012). • Identyfikacja gatunku i mieszańców w ramach rodzaju Larix – modrzew (lata 2008-2012). • Identyfikacja pochodzeń populacji świerka pospolitego, w kontekście północnego i południowego zasięgu gatunku (lata 2008-2012).

33. PRACOWNIA ANALIZY DNAPROPOZYCJE INNYCH ZADAŃ • Opracowywanie map zmienności genetycznej Cisa pospolitego w ramach programu ochrony i restytucji tego gatunku w Polsce. • Ocena wartości genetycznej i weryfikacja plantacji nasiennych i plantacyjnych upraw nasiennych wybranych gatunków w Polsce. • Ocena genetyczna różnych pochodzeń Jodły pospolitej i wybór odpowiednich sprawdzonych pochodzeń do programu restytucji tego gatunku w Polsce.

34. PRACOWNIA ANALIZY DNAPROPOZYCJE INNYCH ZADAŃ c.d. • Prace nad genetyczną charakterystyką populacji i genotypów wybranych do ochrony zasobów genowych i przechowywanych w LBG Kostrzyca. • Opracowanie metodyki sprawdzania pochodzenia drewna kradzieży tego surowca (roczne straty z tego tytułu opiewają na kwotę ok.4 800 000,0 zł –dane głównego inspektora Straży Leśnej DGLP Tadeusza Pasternaka). • Prace nad genetyczną charakterystyką gatunków roślin wchodzących w skład flory obszarów Natura 2000.

35. PRACOWNIA ANALIZY DNAPROPOZYCJE INNYCH ZADAŃ c.d. • Badanie zmienności genetycznej populacji wilka szarego (Canis lupus lupus). • Badania takie prowadzi min.: • Zakład Badania Ssaków PANul. Waszkiewicza 1, 17-230 Białowieża

36. PRACOWNIA ANALIZY DNAPROPOZYCJE INNYCH ZADAŃ c.d. • LBG Kostrzyca deklaruje chęć współpracy w dziedzinie badań genetycznych. • Warunki: • Opieka merytoryczna. • Zatwierdzenie metodyki przez Radę Naukową LBG (opiekun naukowy wejdzie w skład RN LBG Kostrzyca). • Zatwierdzenie metodyki przez Dyrektora Generalnego LP. • Umożliwienie pracownikom LBG publikowania artykułów min. w prasie leśnej, współuczestnictwa w programach badawczych, wykorzystania danych do własnych publikacji.

37. PRACOWNIA ANALIZY DNAwarunki dot. badań genetycznych wilka szarego (lub innego zaproponowanego gatunku fauny lub flory). • Określenie warunków finansowania badań genetycznych wilka (lub innego zaproponowanego gatunku fauny lub flory) w LBG Kostrzyca (badania na zlecenie, w ramach grantu z LP dla innej jednostki badawczej, w ramach działalności statutowej LBG itp. oraz priorytetu tych badań w świetle ustaleń Rady Nauk LBG, Wydziału Gospodarki Leśnej oraz podjętych dotychczasowych działań przez Kierownictwo LBG Kostrzyca.

38. PRACOWNIA ANALIZY DNAURZĄDZENIA LABORATORYJNE • Dygestorium, • Minikomora laminarna do PCR, • Termocyklery, • Termobloki, • Aparat do elektoforezy,

39. PRACOWNIA ANALIZY DNAURZĄDZENIA LABORATORYJNE c.d. • Wirówka z chłodzeniem, • Zamrażalka, lodówka, • Biofotometr, • Waga laboratoryjna, • System oczyszczania wody,

40. PRACOWNIA ANALIZY DNAURZĄDZENIA LABORATORYJNE c.d. • Homogenizator, • Pipety automatyczne, • Autoklaw, • Automatyczny sekwenator DNA +oprogramowanie do analizy DNA

41. PRACOWNIA ANALIZY DNAŹródła finansowania • Zakupu urządzeń dokonano dzięki dotacjom z: - NFOŚiGW, -WFOŚiGW we Wrocławiu, - środkom własnym.

42. DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ mgr Małgorzata Pałucka LBG Kostrzyca 25-04-2007 r.