A utilização de bacteriófagos no controle de Salmonelas em aves e suínos

1. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento A utilização de bacteriófagos no controle de Salmonelas em aves e suínos Laurimar Fiorentin Méd. Vet., M. Sc., Ph.D. Pesquisador da EMBRAPA Suínos e Aves Cx. P. 21, 89700-000 Concórdia, SC.

2. Bacteriófagos e o CBM • Durante o CBM de 2003 (17 a 20 de novembro, Florianópolis, SC), professores e pesquisadores brasileiros criam informalmente um grupo interessados na pesquisa de bateriófagos. • Em 2004 a Página Brasileira de Bacteriófagos é publicada na Rede Mundial de Computadores.

3. Esta apresentação • Histórico. • Utilização de bacteriófagos no controle de Salmonelas em suínos e aves. • Literatura. • Trabalhos da Embrapa Suínos e Aves. • Perspectivas.

4. Bacteriófagos • Vírus que atacam bactérias, em geral com estreito espectro de ação. • Com cabeça e cauda ou filamentosos. • dsDNA, ssDNA, RNA. • Líticos ou lisogênicos. • Entre 20-200 nm.

5. Bacteriófagos líticos

6. Bacteriófagos lisogênicos

7. Histórico

8. Histórico • 1896: O bacteriologista inglês Ernest Hankin relata que água de alguns rios podem inativar o agente do cólera.

9. Histórico • 1915: Frederick W. Twort, do Brown Institution de Londres, observa que culturas de bactérias se tornam translúcidas e demonstra a transmissibilidade do fenômeno. • 1914-1918: Primeira Guerra Mundial.

10. Histórico • 1917: Félix d’Hérelle observa placas translúcidas em inoculações de agar com fezes de pacientes com disenteria, descreve os vírus de bactérias e propõe o termo“Bacteriófagos”. • Revolução Bolchevique.

11. Histórico • 1923: Após passar cinco anos com Félix d’Hérelle no Instituto Pasteur, Dr. Giorgi Eliava funda um instituto bacteriológico em T’bilisi, República da Geórgia, já sob o domínio soviético.

12. Histórico • 1929: Alexander Fleming descobre a penicilina abre a era dos antibióticos. "Cogito ergo sum” (“Penso logo existo”) Renée Descartes

13. Histórico • 1934: Após resultados conflitantes em testes clínicos a “American Medical Association” recomenda o abandonar as pesquisa com bacteriófagos. • Bacteriófagos selecionados não eram de grande virulência. • Uso de apenas um bacteriófago no tratamento. • Lisogenia. • Resíduos bacterianos no preparado.

14. 1920: Os soviéticos retomam a Geórgia.

15. Histórico-Eventos recentes- • Nenhuma nova classe de antibióticos tem sido descoberta nos últimos 30 anos. • O desenvolvimento de resistência múltipla aos antimicrobianos provocou uma revisitação aos bacteriófagos. • O consumidor exige a inocuidade dos alimentos quanto a resíduos químicos.

16. Revisitação dos bacteriófagos • Smith e Huggins, 1982. • 3 x 107 UFC de E. coli K1 no músculo gastrocnêmio (100 x vezes a DL50). • Um bacteriófago teve a mesma eficiência que múltiplas doses de estreptomicina e foi mais efetivo que a tetraciclina, a ampicilina, o cloranfenicol ou trimetoprim com sulfadialzole, tomando-se como comparação o número de camundongos mortos por grupo. • Smith e Huggins, 1983. • Embora bacteriófagos para fimbrias adesivas K88 e K99 não puderam ser selecionados, bezerros tratados tiveram menor número de células aderidas à membrana do intestino delgado, a severidade da infecção reduziu e os animais não tiveram tiveram perda de fluido. • Bactérias resistentes aos bacteriófagos foram reisoladas de bezerros não curados.

17. Uma hipótese muito simples!! Bacteriófagos líticos podem ser utilizados de forma racional na redução da carga bacteriana em animais vivos, resultando em menos contaminação dos produtos que chegam ao consumidor.

18. Bacteriófagos x Salmonelas-Aves- • Berchieri, Lovell & Barrow 1991. • 72% dos animais em contato foram positivos para bacteriófagos 3 dias após a inoculação. • Redução na concentração de UFC de S. typhimurium no duodeno, ceco e fígado somente foi verificada com inoculações em doses > 1010 UFC/ave por via oral. • Sklar e Joerger, 2001. • Tratamento com bacteriófagos em galinhas infectadas com S. Enteritidis reduziu a eliminação comparado com os controles, porém os animais tratados ainda tiveram entre 105 e 107 UFC/g de conteúdo cecal . • Foram reisoladas colônias resistentes ao bacteriófagos.

19. Bacteriófagos x Salmonelas-Aves- • Goode et al., 2003. • Bacteriófagos líticos aplicados em MOI 100 e MOI 1000 reduziram 2 log de S. Enteritidis em pele de frangos. • A redução foi total para UFC 102/cm2 e a MOI 105. • Toro et al., 2005. • Um coquetel de bacteriófagos líticos inoculados pela via oral em frangos reduziu de 81,8 para 1.1 UFC de S. typhimurium por mL de conteúdo do íleo.

20. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • Hipóteses: 1. Bacteriófagos podem reduzir concentração de salmonelas em aves e suínos vivos e conseqüentemente em seus produtos. 2. É possível o uso de bacteriófagos na forma de uma tecnologia de controle de salmonelas em aves.

21. Salmonella Enteritidis • Salmonela de roedores que infecta galinhas sem produzir sinais e lesões. • S. Enteritidis aparece como contaminante de frangos em 60% dos casos (Santos et al., 2000). • O fago tipo 4 representa até 57,65% dos isolados de SE (dos Santos et al., 2003). • Controle multifatorial • HACCP • BPP • Probióticos/prebióticos • vacinas • Antibióticos

22. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • Bacteriófagos líticos para S. Enteritidis fago tipo 4 e S. Typhimurium (ATCC 14028) foram pesquisados em fezes de: • 40 poedeiras coloniais • 45 reprodutoras comerciais de corte • 13 emas • 9 “pools” de pássaros diversos.

23. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • Cinco bacteriófagos foram isolados e denominados CNPSA 1, CNPSA 2, CNPSA 3, CNPSA 4, e CNPSA 5, sendo 4 de galinhas coloniais enquanto o CNPSA 5 foi isolado de um “pool” de fezes de pássaros criados em cativeiro. • CNPSA2 perdeu viabilidade.

24. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • Bacteriófagos são “Lambda-like” em ultra estrutura. • São dsDNA. • Bacteriófagos CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4 apresentara-se diferenciáveis pelo RAPD e foram selecionados para estudos adicionais. • Têm estreito espectro de sorovares. • Não se multiplicam em conteúdo do trato digestivo de suínos e aves livres de salmonelas.

27. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • RAPD diferenciou CNPSA1, CNPSA3, CNPSA4 e CNPSA4/CNPSA5, formando três grupos distintos. • Todos os bacteriófagos isolados são do tipo cabeça e cauda.

28. Estudos da Embrapa Suínos e Aves - Espectro de ação

29. Estudos da Embrapa Suínos e Aves - Espectro de ação em isolados de S. Typhimurium.

30. Estudos da Embrapa Suínos e Aves - Dinâmica de lise- S. Typhimurium S. Enteritidis

31. Estudos da Embrapa Suínos e AvesDinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas experimentalmente com Salmonella Typhimurium S. Typhimurium Bacteriófagos Trat 1: fezes suínas + BHI + S. typhimurium Trat 2: fezes suínas + BHI + S. typhimurium + Bacteriófagos MOI 100 Trat 3: fezes suínas + BHI+ Bacteriófagos

32. Estudos da Embrapa Suínos e Aves Bacteriófagos nas fezes • Pintos SPF inoculados via oral com CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4. 3o dia 5o dia 16o dia Necropsia 103 SE PT4 105cada bacteriófago

33. Estudos da Embrapa Suínos e Aves UFC no conteúdo cecal • Pintos de corte inoculados via oral com CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4. Redução de 3,5 logs. 1o dia 7o dia 32o dia SE PT4 “seeders” 1011cada bacteriófago Necropsias a cada 5 dias

34. Estudos da Embrapa Suínos e Aves UFC/g (log10) no conteúdo cecal • Pintos de corte inoculados pela água de bebida com 109 UFP/mL de CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4. 6o a 11o dia 1o dia 20o dia 6 x106 SE PT4 via oral 109cada bacteriófago Necropsias a cada 3 dias

35. Estudos da Embrapa Suínos e AvesExcreção de bacteriófagos líticos para Salmonella Typhimurium em suínos infectados experimentalmente Delineamento Resultados 1. (gST+BL) foi infectado com uma cultura de ST contendo 107 UFC/mL e recebeu  uma suspensão dos três BL no título de 1010 UFP/mL, dois dias após. 2. (gST) recebeu apenas a cultura de ST. 3. (gBL) recebeu somente a solução de BL. 4. (gC) permaneceu como controle negativo . Nenhum suabe foi positivo para bacteriófagos no dia zero em todos os grupos e em todas as colheitas dos grupos gST e gC.  No segundo dia pós-tratamento (p.t.), 4/5 e 5/5 animais dos grupos gST+BL e gBL eliminavam os vírus nas fezes. No dia 4 p.t., a positividade foi 2/5 e 1/5 respectivamente. No dia 6p.t., os fagos já não foram mais detectados nas fezes de nenhum dos animais inoculados.

36. Estudos da Embrapa Suínos e Aves • Coxas e sobrecoxas imersas em 106 UFC/mL de SE PT4 e depois tratadas com 109 UFP/mL dos bacteriófagos CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4. Log10 x dia pós -tratamento

37. Perspectivas na Embrapa Suínos e Aves • Redução do impacto da infecção por SE PT4 em frangos. • Redução da contaminação de carcaças de frangos infectados. • Potencial aplicação em incubatórios e dejetos. • Utilização em diagnóstico. • Mais experimentação com S. Typhimurium em suínos.

38. Perspectivas • Bacteriófagos irão substituir os antibióticos? • Não. Provavelmente irão estabelecer um nicho próprio (uso tópico, respiratório, gastro-intestinal). • Antibióticos e bacteriófagos poderão ser utilizados conjuntamente? • Sim. Bacteriófagos como preventivo e antibióticos como curativo.

39. Resumindo • Bacteriófagos foram mais pesquisados e utilizados nos países da cortina de ferro. • O mundo ocidental recentemente “descobriu” os bacteriófagos como agentes terapêuticos. • Mais pesquisas são necessárias para definir melhor a utilização dos bacteriófagos em animais de criação. • A Embrapa Suínos e Aves estabeleceu um programa para pesquisar o controle de Salmonelas com bacteriófagos. • Resultados iniciais são encorajadores para perseguir no método como uma tecnologia. • Os bacteriófagos devem se confirmar como uma alternativa aos antibióticos.

40. http://www.cnpsa.embrapa.br/bacteriophages/indexBazilianPageBacteriophages.htmlhttp://www.cnpsa.embrapa.br/bacteriophages/indexBazilianPageBacteriophages.html

41. Publicações Silveira, R.H. 1, Fiorentin, L.2, Voss, D.2, Kich, J.D.2, Cerqueira, A.M.F.1 Host spectrum of indigenous Salmonella lytic bacteriophages. Submetido ao I3S 2006. Silveira, R.H. 1, Fiorentin, L.2, Voss, D.2, Kich, J.D.2, Cerqueira, A.M.F. In vitro dynamic of lysis of indigenous bacteriophages to Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium. Submetido ao I3S 2006. FIORENTIN, L.; VIEIRA, N. D.; BARIONI JUNIOR, W. Oral treatment with bacteriophages reduces the concentration of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contents of broilers. Avian Pathology, 34(3): 258-263. 2005. FIORENTIN, L.; VIEIRA, N. D.; BARIONI JUNIOR, W.; BARROS, S. “In vitro” characterization and “In vivo” properties of Salmonellae lytic bacteriophages isolated from free-range chickens. Braz. J. Poult. Sci.,6(2): 105-112. 2004. FIORENTIN, L., VIEIRA, N.D.; BARIONI JUNIOR, W. Bacteriófagos reduzem a contaminação por Salmonela em coxas e sobrecoxas de frangos. In: Conferência APINCO 2005 de Ciência e Tecnologia Avícolas. Revista Brasileira de Ciência Avícola, 2, Suppl. 7, 185. 2005. FIORENTIN, L., VIEIRA, N.D.; BARIONI JUNIOR, W. Reduction of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contends after treatment with bacteriophages.Annual Meeting of the American Association of Avian Pathologists, 2004. Philadelphia, PN, AAAP. CD-ROM. FIORENTIN, L., Vieira, N.D.; Barioni Jr, W. “In vivo” properties of lytic bacteriophages isolates in Salmonella Enteritidis infected and uninfected SPF chickens. In: Congress of the World Veterinary Poultry Association, 13., 2003, Denver, Co., Anais. Denver: World Veterinary Poultry Association, 2003. p.161. Excreção de bacteriófagos líticos para Salmonella Typhimurium em suínos infectados experimentalmente.Dinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas experimentalmente com Salmonella Typhimurium

42. Obrigado!!