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STUDIO DELLE PROTEINE

STUDIO DELLE PROTEINE. cromatografia. Frazionamento. Metodi non meccanici:. :. centrifugazione. Chiarificazione dell’estratto. L’estratto grezzo deve essere “pulito” prima di procedere al frazionamento

hayley
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STUDIO DELLE PROTEINE

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Presentation Transcript

  1. STUDIO DELLE PROTEINE

  2. cromatografia

  3. Frazionamento Metodi non meccanici: :

  4. centrifugazione

  5. Chiarificazione dell’estratto • L’estratto grezzo deve essere “pulito” prima di procedere al frazionamento • Conviene allontanare subito gli acidi nucleici, ribosomi mediante precipitazione (protamina solfato) • Nel caso contiene molto materiale insolubile si può centrifugare • Molto efficaci sono le tecniche che sfruttano la diversa solubilità delle singole proteine

  6. Sviluppo passaggi di purificazione m= 1/2SciZ2i • Solubilità differenziale

  7. METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE • Punto isoelettrico • Calore • Precipitazione frazionata con Sali (salting-in/salting out) • Solventi organici • Con polimeri organici (PEG) • pH estremi

  8. Esempio di precipitazione frazionata

  9. Sviluppo di passaggi cromatografici • Per stabilire la tecncica cromatografia più utile per la nostra proteina bisogna tenere conto di alcuni parametri generali: -la capacità e la resa del processo cromatografico; -la diluizione della proteina nel passaggio cromatografico; -la velocità, -la conservazione dell’attività durante il passaggio; -il costo dell’intero processo. Criterio generale: assemblare una serie di passaggi che separano le proteina secondo proprietà diverse.

  10. Concentrazione per ultrafiltrazione e conservazione • La concentrazione si realizza forzando acqua e piccole molecole attraverso una membrana semipermeabile usando alta pressione o centrifugazione. • Sono disponibili commercialmente diverse membrane con intervallo di peso molecolare tra 500 e 300.000 (Amcon, Millipore) con dimensioni di pori 0,1-10 mm. • Le proteine purificate in genere vengono conservate a basse temperature (-80°C). Spesso si aggiungo agenti criogeni (glicerolo, glicole etilenico, DMSO) per stabilizzare la proteina durante il congelamento e scongelamento.

  11. Dialisi

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