Caratterizzazione strutturale delle proteine

1. Caratterizzazione strutturale delle proteine X-ray NMR

2. Cristallografia a raggi X • 2) NMR • (NuclearMagneticResonance)

3. LA STORIA • Viene cristallizzata l’ emoglobina. • Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpiscono un bersaglio metallico si origina una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamò raggi X. • Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H.Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg). • Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina). • Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA. • Pauling e Corey propongono i concetti di struttura a-elica e foglietto b in base a considerazioni teoriche. • Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins. • Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X. • Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore. • Anni ‘80 HartmutMichel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione fotosintetico).

4. The paper

5. The model

6. Maurice Wilkins M.H.F. Wilkins, A.R. Stokes, H.R. Wilson: Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171, 738 (1953)

7. Rosalind Franklin R.E. Franklin and R.G. Gosling Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate, Nature 171, 740 (1953)

8. Nobel laureates 1962 Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew

9. Cristallografia a raggi X • Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di strutture 3D a risoluzione atomica • • Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita • • Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle macromolecole • • Svantaggi: • – cristalli singoli • – altamente ordinati • – ragionevolmente grandi (80-100 μM)

10. Cristallografia a raggi X Precisa determinazione della posizione atomica Cristallidellaproteina • 0.3-1.0 mm • Le singolemolecolesono ordinate in modoperiodico, ripetitivo Salting out non è sufficiente

11. La solubilità della proteina è determinata dalle interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina Lys, Arg, Asp, Glu Un eccesso di forza ionica della soluzione favorisce le solvatazione degli ioni stessi a scapito della solvatazione della proteina. Il sale compete con la proteina e la solvatazione diminuisce all’aumentare della forza ionica L’aumento della forza ionica della soluzione favorisce la interazione tra le cariche superficiali della proteina ed il solvente polare

12. Polietilenglicole: proteina precipita, ma rimane in contatto con l’acqua. Struttura ordinata con indice di rifrazione diverso rispetto a quello del mezzo in cui si trova

13. Perchè i raggi X? Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica deve essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti: distanza interatomica ≈1Å (10 nm) λraggiX= 0.1 ÷ 2 Å con i raggi X “vedo” gli atomi

14. Visione d’insieme del processo RX FFT Cristallizzazione Diffrazione Risoluzione della struttura e affinamento

15. …perché un cristallo? L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola MA: - è troppo debole - impossibile separarla dalla radiazione di fondo (soluzione) Impossibile ricostruire la molecola

16. In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato nelle tre dimensioni Cristallo è amplificatore del segnale buone immagini di diffrazione si può ricostruire la molecola 100 mg!!

17. Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.

18. Instrumentation or synchrotron X-rays

19. Instrumentation ESRF - Grenoble

20. Instrumentation Elettra - Trieste

21. The Bragg law Facendo incidere un'opportuna onda elettromagnetica su di un cristallo si osservano fenomeni di interferenza, causate dalla riflessione di onde riflesse da piani cristallini diversi, ma paralleli. l = 2 d sinq Dove: - θ è l'angolo che il fascio incidente forma con il piano cristallino - λ è la lunghezza d’onda della radiazione- d è la distanza tra due piani adiacenti. sinq/l = 1/(2 d) d = l / (2 sinq)

24. Acqua Agente precipitante Soluzione cristallizzante acqua/acetone cloroformio o cloruro di metilene/etere di petrolio o esano

25. Crystal growth

26. Crystal growth

28. Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi? + = Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D • La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione. • • La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.

29. Risoluzione

30. Esempio: la proteasi del virus HIV La cavità centrale è ampia e può legare un polipeptide in conformazione estesa

31. KNI577 • La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato: inibitori competitivi altamente specifici e selettivi • Nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti • collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi

33. MODULATION OF HEME AND MYRISTATE BINDING TO HUMAN SERUM ALBUMIN BY ANTI-HIV DRUGS. AN OPTICAL AND NMR SPECTROSCOPIC STUDY(FEBS J. 274 (2007) 4491-4502) Superimposition of myristate and abacavir (panel A), nevirapine (panel B), and atazanavir (panel C) in binding site FA6. Ligands are colored as follows: myristate: green; abacavir: blue; nevirapine: orange; atazanavir: cyan. Atomic coordinates were taken from the PDB entry 1O9X (Zunszain et al., 2003).

34. Heme Binding to Albuminoid Proteins is the Result of Recent Evolution, IUBMB Life 59, 436-440 (2007).

35. 2) NMR • Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica • • È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti Informazioni di: – dinamica – conformazione – folding – interazioni intermolecolari

36. Campo magnetico NOE (Nuclear Overhauser Effect)

37. Il campo magnetico Magnete a 400 MHz Magnete a 900 MHz Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M € n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

38. Magnetic Resonance Center - Firenze

39. The Magnet History First magnets were built using ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire. A “cutted” magnet

40. Orbita di precessione B0 Dipolo magnetico μN Nucleo La rotazione dei nuclei atomici su sé stessi è capace di procurare un momento magnetico μ se i nuclei sono carichi. Solo nuclei con numero atomico dispari mostrano proprietà magnetiche: si dice che il loro numero quantico di spin è ±1/2. Solo particelle dotate di spin sono in grado di disporsi in diversi livelli energetici se immerse in un campo magnetico. Momento magnetico Frequenza di Larmor

41. L’energia della transizione NMR Si applica un campo magnetico B0: il momento magnetico del protone tenderà ad allinearsi con il campo esterno. Si creano due livelli energetici: uno, ad energia più alta, in cui il suo momento magnetico si oppone al campo esterno; uno, ad energia più bassa, in cui è allineato. m=-1/2 E= -m•B0 DE=h0 DE=g(h/2p)B0 E m=+1/2 B0 Larmor Frequency Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

42. L’energia della transizione NMR E= -m•B0 DE=g(h/2p)B0 Devo applicare una radiofrequenza = alla frequenza DE=h0 Per stimolare la transizione! E m=-1/2 DE=h0 Il campo di radiofrequenza utilizzato per eccitare la transizione si chiama anche B1 m=+1/2 B0 Larmor Frequency B1 deve emettere una radiofrequenza in corrispondenza della frequenza di Larmor

44. Some paradigmatic examples

45. Why? NMR is a unique method to obtain information in solution AT THE ATOMIC LEVEL. Each individual atom has a peculiar resonance frequency. Because the resonance frequency depends on the environment of the atom, EACH atom has a different resonance frequency and can, therefore be identified CH3-CH2-OH equivalent

46. H H H H H H H Structure H Interactions H H H Spectrum NMR Spectrum to 3D Structure

47. Challenges For Determining Protein Structures Using NMR • Proteins have thousands of signals • Assign the specific signal for each atom • Thousands of interactions between atoms- also need to be assigned • Need to transform from NMR spectrum through interpretation of scalar and dipolar interactions to generate 3D coordinates

48. OH CH2 CH3 The key attribute: use the scalar and dipolar couplings to match the set of signals with the molecular structure Resonance Assignment CH3-CH2-OH Which signal from which H atoms?

49. Proteins Have Many Signals 1H NMR Spectrum of Ubiquitin ~500 resonances • A large number of signals are overlapped

50. A Critical Feature of Protein NMR Spectra • Only some nuclei are coupled • Each amino acid gives rise to an independent NMR sub-spectrum, which is much simpler than the complete protein spectrum Methods have been developed to extract each sub-spectrum from the whole