Purificazione e caratterizzazione delle proteine

1. Purificazione e caratterizzazione delle proteine

2. Purificazione e caratterizzazione delle proteine • Purificazione: • Cromatografia • Elettroforesi • Caratterizzazione: • Massa molecolare • Struttura primaria • Struttura secondaria • Folding/Unfolding • Struttura terziaria

3. Purificazione delle proteine

4. Precipitazione delle proteine • Globuline: Carica elettrica uniformemente distribuita. Precipitano per salting out (effetto cosmotropico) • Albumine: Carica elettrica disomogenea. Aggregano in assenza di controioni. Precipitano per salting out (effetto cosmotropico)

5. Precipitazione delle proteine • Salting out (effetto cosmotropico), es. (NH4)2SO4 • Solventi (acetone freddo, acetone + acido) • Denaturazione termica

6. Purificazione delle proteine

7. Gel filtrazione • L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica. • La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosità controllata. • Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione. • Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matrice esce con un volume di eluente pari al Void Volume (volume vuoto).

8. Gel filtrazione

9. Gel filtrazione

10. Gel filtrazione • Vantaggi • Semplice • Prevedibile • Svantaggi • Bassa capacità (piccoli volumi) • Soluzioni non viscose

11. Gel filtrazione

12. Determinazione peso molecolare Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

13. Cromatografia di scambio ionico • Scambio anionico • A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico. • L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare). • Scambio cationico • A pH minore del pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico. • L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.

14. Scambiatori ionici

15. Cromatografia di scambio ionico

18. VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali. Cromatografia di scambio ionico

19. Cromatografia per interazione idrofobica (HIC) • È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicità di superficie. • I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate • le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. • È una cromatografia che è vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. • L’eluizione può essere fatta con forza ionica decrescente oppure per “spiazzamento” con detergenti non ionici (Tween 20, Triton X-100). • Potenziali svantaggi: • in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione. • non è predicibile, può applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre.

23. Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

24. Cromatografia di affinità • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice • La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna • Le altre proteine vengono “lavate” via. • La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

25. Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità

26. VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame L’eluizione può richiedere un eluente specifico Cromatografia di affinità

27. Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: TAG GST MBP biotina Poli-His Proteina A Affinity tags • LIGANDO • Glutatione • Maltosio • Avidina • Nichel, Zinco • Anticorpi • Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. • Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

28. Purificazione di anticorpi monoclonali

29. Cromatografia di affinità con anticorpi

30. Proteine di fusione (es. GST, glutatione-S-transferasi)

31. Immobilized metal ion Affinity Chromatography (IMAC)

32. Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

33. Protocollo generale di purificazione proteine

34. Obiettivi: • Cattura • Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio • Purificazione intermedia • Eliminare la maggior parte dei contaminanti • Polishing • Ottenere la massima purezza possibile

36. AC: affinity chromatography IEX: ion exchange HIC: hydrophobic interaction chromatography GF: gel filtration RPC: reverse phase chromatography

38. Desalting

39. Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi. Cattura e purificazione intermedia mediante IEX

40. Esempio di cattura mediante HIC

41. Cattura IEX su resina Q • Purificazione con HIC • Polishing per GF

42. Metodi per ottenere informazioni sulla sequenza aminoacidica delle proteine

43. Composizione amminoacidica Derivatizzazione post-colonna

44. Derivatizzazione post-colonna

45. Determinazione dell’estremità N-terminale

46. Metodo di Sanger (FDNB) ed altri reattivi

47. Degradazione di Edman

49. Sequenziamento automatico

50. Degradazione di Edman