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Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena). Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35 S ha bisogno di:

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Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

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Presentation Transcript

  1. Il metodo Sanger • (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

  2. Terminazione della catena La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

  3. Schema di sequenziamento a terminazione di catena 3’-GGCTAAC 3’-GGCTAAC 5’ 3’ DNA stampo a singola elica Ibridazione con Il primer + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C Direzione di lettura C Sequenza: 5’-CCGATTG

  4. Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

  5. Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

  6. AGTACTG G GATC Gel Electrophoresis Fluorescent DNA Sequencing

  7. Detection of Fluorescently Tagged DNA Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer DNA Fragments Separated by Electrophoresis

  8. Fluorescent DNA Sequencing Data

  9. Fluorescent DNA Sequence Trace

  10. Overview of Facts Asserted • 2.91 billion base pairs (bp) • 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA • 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) • less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

  11. Structure of the genome

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