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Escherichia coli

3 m m. http://genolist.pasteur.fr/Colibri/. Escherichia coli. Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato Presenza di plasmidi stabili. Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA

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Presentation Transcript

  1. 3 mm http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ Escherichia coli • Molto studiato da un punto di vista genetico, fisiologico e strutturale • Genoma: cromosoma circolare interamente sequenziato • Presenza di plasmidi stabili

  2. Plasmidi MOLECOLE DI DNA CAPACI DI REPLICAZIONE AUTONOMA (DIMENSIONI ca. 103-104 kBp) DNA CIRCOLARE CHIUSO, SUPERAVVOLTO PRESENTI IN UN NUMERO DI COPIE DIPENDENTE DALLA LORO ORIGINE DI REPLICAZIONE (plasmidi generalmente usati per applicazioni biotecnologiche: 50-250 copie/cellula) GENI PER LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI (MARKER SELETTIVI) bla= resist. ampicillina ColE1= origine di replicazione

  3. La regione di importanza “clou” del vettore d’espressione: il Multiple Cloning Site (MCS) Il gene codificante la proteina di interesse deve essere clonato (=inserito) nel vettore d’espressione a valle di un promotore specifico. A questo scopo il vettore di espressione contiene un multiple cloning site, cioè una sequenza ricca in sequenze di riconoscimento di nucleasi di restrizione (siti di restrizione)

  4. L’uso di enzimi di restrizione è alla base di gran parte delle tecnologie del DNA ricombinante Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica sul DNA e introducono un taglio a doppia elica in prossimità (Enzimi di classe I, classe III) o in corrispondenza (Enzimi di classe II) del sito di riconoscimento. Sono disponibili un alto numero di Nucleasi di restrizione di classe II che riconoscono siti di legame diversi e tagliano il DNA con risultati diversi (estremità coesive 5’ o 3’) o taglio “blunt end”.

  5. L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse

  6. Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe • Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) • La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) • La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

  7. Cosa occorre per l’espressione ad alto livello di una proteina nella cellula? • Trascrizione/traduzione/stabilità Promotore forte (trascrizione) Presenza di segnali per il riconoscimento dell’mRNA da parte dei ribosomi (traduzione) Assenza di proteasi specifiche (stabilità)

  8. Il “Promotore perfetto” (?) UP element -35 Ext. -10 D +1 AAATAAAATTTTTAAn..nTTGACAnnn…nnnTGnTATAATnnattAn 14nt 4-6nt 4-6nt 17nt Riconosciuti dalla subunità s Riconosciuto dalla subunità a +1 5-7 nt An....nAGGAGGnn..nnATG~ ORF (gene di interesse)-TAAnnnnn Term. (Ribosome Binding Site/ SD box (Shine-Dalgarno) Terminatore di trascrizione

  9. Produzione di proteine eterologhe • Domanda: Un sistema “spinto al massimo”, cioè alto livello di trascrizione unito ad un alto livello di traduzione è il meglio che si possa avere per la produzione di proteine eterologhe? Risposta: NO Problemi di “tossicità” di proteine eterologhe, e della loro conformazione corretta

  10. Tossicità di proteine eterologhe nell’ospite Escherichia coli • Peso sul bilancio energetico della cellula batterica • Interazione “erronea” con componenti cellulari: Legame al DNA Danno al DNA Stress ossidativo Interazione/sequestro di altre proteine essenziali Induzione di sistemi di risposta allo stress

  11. Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Produzione di proteina (unità arbitrarie) Crescita bloccata e/o lisi cellulare

  12. Induzione di un promotore: un modo di superare problemi di tossicità Induzione Crescita non inibita Crescita rallentata Crescita bloccata e/o lisi cellulare Crescita di un ceppo che esprime una proteina tossica da un promotore costitutivo

  13. Plac, il promotore inducibile „per eccellenza“ A B (LacI) (LacI) (naturale: allolattosio; sintetico: IPTG)

  14. IPTG Plac LacI Ptac Ptrc Derivati di Plac* più forti *) sostituzioni nella seq. -10 o promotori ibridi

  15. Phage T7

  16. Promotore dipendente da RNA polimerasi di batteriofago T7 (T7-RNA pol) T7-RNA pol: singolo polipeptide estremamente efficiente (molto più dell’RNA polimerasi batterica)

  17. AraC Ara C PBAD • Ara represses PBAD • +Ara induces PBAD AraC RNA pol PBAD

  18. EK=Sito di proteasi Xpress epitope= riconoscimento con anticorpi specifici

  19. L’uso dei siti di restrizione nel MCS permette il clonaggio del frammento di DNA (gene) di interesse Ma troviamo sempresiti di restrizione adatti in prossimità del gene da clonare?

  20. 1 1 3 2 Il gene di interesse viene generalmente amplificato per PCR (polymerase chain reaction) DNA-sintesi (15-20 nt) Ibridazione con sonde specifiche per l’amplificazione del gene bersaglio

  21. Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: AAGCTT GGATCC (HindIII) (BamHI) AAGCTT GGATCC AAGCTT AAGCTT GGATCC GGATCC Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

  22. Aggiunta di siti di restrizione ai Primers: AAGCTT GGATCC (HindIII) (BamHI) GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT GGATCC AAGCTT Ai primers può essere aggiunta una “coda” non complementare alla sequenza bersaglio, che viene incorporata nel prodotto della PCR

  23. Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe • Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) • La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) • La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

  24. Tre criteri fondamentali per la produzione di proteine eterologhe • Espressione ad alto livello, affidabile e stabile del gene di interesse (livello DNA/RNA) • La proteina prodotta deve mantenere la propria attività biologica in E. coli (livello struttura/ conformazione della proteina) • La proteina deve essere facilmente re-isolata dal rimanente materiale cellulare

  25. Fattori post-trascrizionali che possono influenzare l’espressione • Stabilità del mRNA: l’utilizzo di alcuni mutanti in alcune RNasi (ad es. le esonucleasi RNasi II, PNPasi o la endonucleasi RNasiE) può far aumentare la stabilità dei trascritti • Differenze nell’uso dei codoni tra procarioti ed eucarioti può avere un impatto sulla produzione di proteine eterologhe in E. coli (ad es. i codoni arginina AGA e AGG sono molto rari in E. coli, ma molto comuni negli eucarioti). Possibile soluzione: cambiare questi codoni nel codone CGC, preferito da E. coli, oppure co-esprimere il gene per il tRNAArg(AGG/AGA) • Stabilità delle proteine: uso di mutanti defettivi per proteasi

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