DIAGNOSI DI LABORATORIO

1. DIAGNOSI DI LABORATORIO

2. Diagnosi microbiologica • Scopo: • Identificazione agente infettante • Determinazione sensibilità agli antibiotici

3. Diagnosi microbiologica: identificazione agente infettante- Prelievodei campioni:- prima di iniziare terapia antibiotica- effettuato sterilmente nella sede del processo morboso- evitare ogni contaminazione esogena o endogena del campione- Il trasporto del campione al laboratorio deve avvenire in tempi e condizioni che non alterino le caratteristichemicrobiologiche del materiale patologico- Al campione deve essere allegato modulo di richiesta compilato (con eventuali dati anamnestici).

4. Diagnosi batteriologica • Raccolta campione e prelievo: • urocoltura - emocoltura - coprocoltura - liquor - tamponi • Esame microscopico: • osservazione a fresco • colorazione di Gram • colorazione di Ziehl - Neelsen

7. Urocoltura(prima della terapia antibiotica) Prelievo: pulizia locale, mitto intermedio Semina: valutazione quantitativa: conta UFC dopo piastratura di aliquote di urina (diluizioni fino 1:1000) o semina del sedimento dopo centrifugazione. Un valore ≥105 UFC/ml è indice di infezione. Valutazione qualitativa: isolamento su terreni selettivi e differenziali (agar sangue, Mac Conkey, selettivo per Enterococchi,…), vetrino a fresco e colorazione di Gram del sedimento. Identificazione: Gram+ : S. epidermidis; S. aureus; E. faecalis ; Gram - : E. coli; Proteus; Providencia; P.aeruginosa; Klebsiella; Serratia. Antibiogramma

12. Emocoltura Prelievo: disinfettare la cute, eseguire il prelievo sterilmente Test in flacone con terreno liquido Test in bottiglia difasica Test su coagulo Test speciali e test rapidi I microorganismi indicativi di possibile batteriemia sono: Staphylococcus; Listeria; Bacillus;Pseudomonas; Brucella; Haemophilus; E.coli, ecc.

13. Emocoltura Per aumentare la probabilità di isolamento occorre: • effettuare il prelievo immediatamente prima del rialzo febbrile • eseguire prelievi ripetuti nel corso della giornata (almeno 3) • inoculare due bottiglie: una per aerobi e una per anaerobi

14. Il sangue può essere raccolto con la siringa o mediante un sistema chiuso

15. Flaconi per emocoltura

16. E’ preferibile non eseguire il prelievo da cateteri venosi centrali a permanenza. Nel caso di sospetta sepsi a partenza dal catetere, eseguire l’emocoltura dal catetere e da una vena periferica con la tecnica della lisi e centrifugazione, che permette la determinazione della carica batterica. Nel caso di sepsi da catetere, la carica batterica nel sangue periferico sarà di almeno 5 volte inferiore rispetto a quella del prelievo da catetere. I campioni vanno processati immediatamente.

17. Le emocolture e mielocolture per la ricerca dei micobatteri sono eseguite inoculando 10 ml di sangue in una provetta contenente anticoagulante e saponina (che lisa le cellule). A lisi ultimata la provetta si centrifuga e i batteri vengono ricercati nel sedimento.

18. Coprocoltura Prelievo: raccolta di feci e tampone rettale Esame diretto: per la ricerca di miceti e parassiti intestinali Semina in terreni di arricchimento: per facilitare lo sviluppo di Salmonelle Isolamento in terreno solido (selettivo e differenziale): per la ricerca di E.coli enteropatogeni, Yersinia, C. perfringens, C. jejuni, Shigelle. Antibiogramma

21. Liquor (LCR) Prelievo: puntura lombare (trasporto immediato senza refrigerazione del campione che potrebbe uccidere le Neisserie) Test rapido: campione a 80°C per liberare antigeni e poi test di agglutinazione per la ricerca di Haemophilus, Neisserie, Streptococchi gr. B, Cryptococcus. Identificazione: centrifugazione a 3000 g per 15’, osservazione a fresco del sedimento e colorazione con blu di metilene e Gram; semina in aerobiosi e anaerobiosi.

24. Tampone vaginale e uretrale Prelievo: 3 tamponi dal fornice vaginale prima della minzione): 1 per l’esame microscopico a fresco (protozoi e funghi), 1 per l’esame microscopico con colorazione, 1 per l’esame colturale.

26. Tampone nasale per la ricerca di S. aureus Tampone faringeo per la ricerca di Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Neisseria spp., Corynebacterium spp., Candida. Tampone rinofaringeo Prelievo: tampone sottile montato su filo di alluminio attraverso una narice per la ricerca di Mycoplasma, Neisseria, C. diphteriae, S. aureus. Per la ricerca di B. pertussis si fa tossire vicino ad una piastra con terreno selettivo adatto per questa specie.

27. Tampone auricolare: tamponi sottili Tampone congiuntivale:prelievo con tampone dalla congiuntiva tarsale. Espettorato (prima della terapia antibiotica) Prelievoa digiuno, pulizia cavo orale, induzione colpo di tosse con aerosol. Identificazione: omogenizzato per aumentarne la fluidità, osservazione microscopica a fresco e con colorazione; arricchimento per Micobatteri (in questo caso servono tre campioni prelevati in tre mattine successive).

28. Diagnosi batteriologica Esame colturale - terreni normali terreni arricchiti - terreni selettivi e differenziali

29. Valutazione di fattori di virulenza (enzimi, tossine,…) coagulasi - catalasi - …. Prove biochimiche da una coltura pura sistemi API, Enterotube,… sistemi automatizzati (Phoenix,Vidas,ecc.)

30. Diagnosi batteriologica • Ricerca di enterotossine • Indagini sierologiche • Antibiogramma • Tecniche di biologia molecolare – PCR - test di ibridazione (sonde)

31. Ricerca del batterio patogeno- esame microscopico diretto (utile per materiale normalmente sterile o con popolazione normale diversa da quella ricercata) - colorazione - IF - esame colturale - isolamento - terreni selettivi e differenziali - identificazione - ricerca antigeni batterici con metodi immunologici - evidenza sequenze di genoma batterico con sonde genetiche - PCR - ricerca endotossine Gram - (Limulus o LAL test) – siero- liquor - orineEmocoltura - urocoltura - coprocolturaliquor-escreato-essudato faringeo o tonsillare (tamponi)-secreti (organi genitali)- pus (ferite e ascessi).

32. Antibiogramma colonie resistenti 

34. Diagnosi sierologica Scopo: • Valutare lo stato immunitario di un soggetto • Porre diagnosi di infezione in atto (o superata)

35. L’indagine sierologica può avere diversi scopi: • Test di screening (scopo epidemiologico, valutazione della sieropositività in vista di una vaccinazione) • Scopo diagnostico • Scopo prognostico

36. Possibili approfondimenti dei test sierologici • Titolazione separata di IgG e IgM • Doppia campionatura (è significativo un aumento del titolo di 4 volte)

37. Diagnosi sierologica- Valutazione dello stato immunitario di un soggetto.- Doppio campionamento a distanza di 1-2 settimane per valutare differenze di titolo anticorpale e porre diagnosi di infezione in atto o superata. - utile per malattia con reazioni umorali apprezzabili, - utile per malattia con sospetto clinico che indirizza verso un preciso agente eziologico.

38. Ricerche sierologicheTecniche:- precipitazione : diffusione radiale su agar - agglutinazione: - ricerca anticorpi (salmonellosi, brucellosi,…) - identificazione antigeni batterici con siero immune noto - reazione di immobilizzazione: TPI (batteriocidia)- reazione di fissazione del complemento (IgM) - reazioni di immunofluorescenza- reazioni immunoenzimatiche: ricerca antigeni e anticorpi

39. Test diimmuno-precipitazione Test di Elek-Frobisher per la ricerca della tossina difterica

40. Agglutinazione

41. Test di agglutinazionecon antigenecorpuscolato Salmonelle

42. Agglutinazione di Vidal (Salmonelle)

43. Fissazione del complemento

44. reazione di Wasserman

45. ELISA

46. Kit per determinare la presenza di tossina di C. difficile nelle feci (metodo immunocromatografico)

47. Rilevazione di macromolecole • Ricerca di proteine • Western blot, tecnica immunoenzimatica, immunofluorescenza, agglutinazione al lattice, emoagglutinazione indiretta • Ricerca di metaboliti batterici • gas-cromatografia • Ricerca degli acidi nucleici • PCR (polymerase chain reaction), sonde marcate