Molekuláris klónozás és biotechnológia

1. Molekuláris klónozás és biotechnológia Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén exakt kópiáit kell előállítani. Ezt hívjuk „molekuláris klónozásnak”. A gént tartalmazó DNS-t izolálni kell a genomból. Ez lehet egyszerű – de komoly problémák adódhatnak yfg (your favorite gene)

2. A molekuláris klónozás alapjai • Az alábbiak ismeretét feltételezem • Molekuláris biológia alapjai • Polimeráz láncreakció (PCR=polymerase chain reaction) • DNS szekvenálás

3. Mi a gond egy gén izolálásával? Minden gén ugyanolyan molekulákból épül fel, amelyek kémiailag homogének (DNS = A+C+G+T). Az örökítő anyag nagyon nagy. E. coli >1000 gén (4,600,000 bp) Ember – több mint 10,000 gén (kb. 4,400,000,000 bp) Egy adott gén a genomnak csak picike része. AzE. coli-banegy-egy gén kb.a genom 0,05 %-a Emberbenkb. 0,00005%-a Egy adott gén megkeresése nem ahhoz hasonlít, amikor egy tűt kell megkeresni a szénakazalban, hanem sokkal inkább egy bizonyos fűszálat kell megkeresni a szénakazalban!Ebben az esetben a szénakazal nagyon egyformának tűnik és csak akkor tudjuk megmondani a különbséget, ha minden egyes darabot megvizsgálunk.

4. A genom darabolása kezelhető méretű részekre Restrikciós enzimek - baktériumokból – a baktérium genom integritását védő egyik rendszer részei. Például: EcoRI –E. coli-ból Hat bázispárnyi felismerő hely, ezen belül vág – a megfelelő metiláz (EcoMI) a központi bazispárt metilezi, így védi saját DNS-ét a hasítástól. A tisztított enzimin vitrohasználható eszköz. A DNS-t bármelyik GAATTC szekvenciánál elvághatja - minden genomra jellemző a GAATTC szekvenciák száma és elhelyezkedése és mindig ugyanott vannak. (statisztika)

5. Hogyan tudjuk stabilan fenntartani és szaporítani az idegen DNS darabot? – beültetjük egy stabil replikonba • A plazmid klónozó vektor tulajdonságai • kicsi • A gazdában stabil • Nagy kópiaszám • Könnyű tisztítani • Be tud fogadni idegen DNS-t • Egyszeres„klónozó” helyek • Szelektálható marker – antibiotikum rezisztencia • A gazdába könnyen bejuttatható (transzformáció, transzdukció) pBR322

6. újEcoRI hely Különböző DNS darabok egyszerű fúziója EcoRI EcoRI pBR322, felnyitva az egyszeresEcoRI helynél DNS ligáz+ATP EcoRI EcoRI idegen DNS Rekombináns DNS „ragadós” végek CKKK TTAAGKKK EcoRI vég a vektoron NNNGAATTCKKK NNNCTTAAGKKK Fúziós hely NNNGAATT NNNC EcoRI vég az inzerten

7. a-komplementáió – ab-galaktozidáz enzim modul rendszerű felépítésén alapul - klónozó vektoroknál gyakran alkalmazott alapvető technika – inzerciós inaktíválás • a-komplementáció • LacZ+ - kék telep • LacZ- - fehér telep • ha megszakítjuk alacZ • gént, a telep fehér

8. Hogyan működik aza-komplementáió? Ab-galaktozidáz tulajdonságaira vezethető vissza Néhány E. coli törzs termeli ab-Gal  fragmensét Ha azafragmenst transz (plazmidról) termeltetjük működik a b-Gal

9. Génkönyvtár – az inzert DNS nagysága Minél nagyobb a fragmentum, a genomnak annál nagyobb része lesz egy plazmidban Génkönyvtár készítésekor kiszámíthatjuk a teljes genomot reprezentáló egyedi rekombináns DNS molekulák számát. N =[ln (1-P)]/[ln (1-f)] A humán genomra és egy átlagos plazmidra P – 99%, vagy 0.99 konfidenia f – 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6 P – a teljes lefedettség valószínűsége N – a szükséges egyedi klónok száma f – a genom részaránya az átlagos fragmentum méretben N =[ln .01]/[ln 0.99999886] = -4.6/-1.14 x 10-7 = 40,350,877 egyedi plazmid klón A plazmid vektorok átlagosan 5 kb-nyi Inzertet viselnek el stabilan.

10. Nagy előrelépés! A bakteriofág/cosmid vektorok nagyobb inzertet képesek befogadni Nagyobb inzertek mint a plazmidokban – bevitel fágfertőzéssel 20 – 35 kb inzertek Humán genom és standard fágvektor P – 99%, vagy 0.99 konfidencia f – 35 kb/4,400,000 kb = 7.95 x 10-6 N =[ln .01]/[ln 0.99999205] = -4.6/-7.95 x 10-6 = 578, 616 egyedi klón

11. !!!!!!!!!! Élesztő mesterséges kromoszóma (YAC) ésbaktérium mesterséges kromoszóma (BAC) Átlagosan 300 – 500 kb inzert DNS – nagy genomokhoz remek Humán genom és standard YAC P – 99%, vagy 0.99 konfidencia f – 500 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-4 N =[ln .01]/[ln 0.999886] = -4.6/-1.14 x 10-4 = 40,350 egyedi klón

12. Mi a YAC? (yeast artificial chromsome) élesztő mesterséges kromoszóma Élesztőben önállóan replikálódó vektor. Nagy inzertek befogadására képes.

13. AzE. coliF plazmidjából - Stabil öröklődés - 1-2 kópia/sejt (szigorú kópiaszám szabályozás) Mi a BAC? (bacterial artificial chromsome) baktérium mesterséges kromoszóma - nagyon kis kópiaszám, nagy méretű inzert kapacitás

14. Kész BAC könyvtárak

15. Szabályozott expressziós rendszerek –sok változat araC-PBADkazetta 1. Szoros represszió arabinóz nélkül (és glükózzal) 2. Nagy mértékű aktíválás arabinózzal Többrészes repressziós hurok Transzkripciós aktívátorok I. osztálya

16. Különösen szigorú szabályozás és nagyon nagy expresszió

17. Génfúziós rendszerek – egy gén aktivitásának vizsgálata egy másik génnel fúzionáltatva RIPORTER GÉNEK A legújabb kedvencek az autofluoreszcens fehérjék. HeLa sejtekbengfp és rfpmegnyilvánulás

18. A bakteriális transzpozonok alkalmazása – Tn5

19. Templátok szekvenáláshoz A transzposzóma Mutagenezis baktériumokban

20. Az RNS polimeráz aktiválását segítő faktorok meghatározása – Y2H; B2H rendszerek

21. Élesztő kéthibrid (Y2H) és baktérium kéthibrid rendszerek (B2H) fehérje-fehérje kölcsönhatások meghatározása Egy B2H