Rakubioloogia praktikum II osa

1. Rakuorganellide märkimine immuunofluorestsentsi meetodil.HeLa kasvajarakkudes olevate lüsosoomide, aktiini fiibrite ja tuuma visualiseerimine Rakubioloogia praktikum II osa

2. Töö etapid • Rakkude fikseerimine • Rakkude permeabiliseerimine • Blokeerimine • Töötlus primaarse antikehaga • Töötlus sekundaarse antikehaga ja aktiini fiibritega seonduva värviga • Rakutuumaga seonduva värviga inkubeerimine • Alusklaasile sulundamine

3. HeLa rakud – pärit emakakaela kasvajast, kultuuri viidud 60-ndatel aastatel. Doonoriks naine nimega Henrietta Lacks

4. Rakkude fikseerimine ja permeabiliseerimine I • Fikseerimine – 30 min 4%-lise paraformaldehüüdiga fosfaat-puhverdatud soolalahuses (PBS) – rakus olevad valgud ristseotakse aminohappejäägi lüsiini kaudu

5. Rakkude fikseerimine ja permeabiliseerimine II • Permeabiliseerimine • 2-3 minutit 0,1%-lise Triton X lahusega (lahustiks jälle PBS) – teeb rakumembraani lipiidse kihi auklikuks (detergent!) ja antikehadele ning muudele ühenditele läbipääsetavaks Triton-X 100 molekul

6. Rakkude blokeerimine • Blokeerimine toimub valgulahusega (nt rasvavaba piimapulbri lahus või veise seerumalbumiini lahus). • 15 minutit 10%-lise piimapulbri lahusega PBS-s • Blokeerimislahuse valgud • vähendavad mittespetsiifilist signaali, blokeerides rakkudes kohad, kuhu antikeha võiks mittespetsiifiliselt seonduda (blokeerib ühendite passiivse adsorptsiooni) • stabiliseerivad pindadele seondunud biomolekule.

7. Töötlus antikehadega I sekundaarne antikeha primaarneantikeha primaarneantikeha Otsene märkimine Kaudne märkimine Seda kasutame meie

8. Töötlus antikehadega II • Primaarne antikeha – lüsosomaalse valguga LAMP-2 (lysosome-associated membrane protein 2) seonduv hiires tehtud monoklonaalne antikeha, lahjendus 1:100 (lahjendus teha 3%-lises lõssipulbrilahuses). • Lüsosoomid – madalama pHga (4,8) vesiikulid rakus, mille ülesandeks biomolekulide lagundamine (nukleaasid, proteaasid, fosfataasid jne) • Klaasi rakkudega inkubeerida 30 min ümberpööratult 30 µl-s tilgas, mis asetatakse vaharibale. • Pärast inkubeerimist klaas rakkudega tagasi kannu (rakkudega külg ülespoole!) ja 3x5 min pesu PBS-s.

9. Töötlus antikehadega III • Sekundaarne antikeha – hiirest pärinevate valkudega seonduv antikeha, mille küljes fluorokroom Alexa Fluor 488 (roheline) • Samasse lahusesse lisatud ka aktiini fiibritega seonduv seenest pärit metaboliit falloidiin, märgitud fluorestseeruva ühendiga Alexa Fluor 594 (punane)

10. Töötlus antikehadega IV • Inkubeerida rakkudega klaasi sekundaarset antikeha ja falloidiini sisaldava 3% lõssipulbrilahusega 15 minutit ümberpööratult 30 µl-s tilgas, mis asetatakse vaharibale. • Pärast inkubeerimist klaas rakkudega tagasi kannu (rakkudega külg ülespoole!) ja 4x5 min pesu PBS-s. • 3. pesu teha PBS-ga, kuhu lisatud tuumaga seonduv värv Hoescht (lahjendus 1:1000) • Pärast pesu Hoescht-ga teha veel üks pesu PBS-ga

11. Klaaside sulundamine alusklaasile I • Sulundusvedelik peab säilitama fluorestseeruva ühendi fluorestsentsi ergastava valguse mõjul võimalikult hästi • Erinevaid sulundajaid palju, tihti tuleb eri fluorokroomide puhul kasutada kindlaid sulundajaid, et vältida pleekumist.

12. Klaaside sulundamine alusklaasile II • Alusklaasile panna 10 µl sulundusvedelikku (30% glütserooli PBS-s) • Klaas tõsta kannust välja ja nõrutada vastu paberkäterätti liigsest PBS-st. Mitte segi ajada klaasi külgi! • Klaas lasta ettevaatlikult sulundusvedeliku sisse. • Üleliigne sulundusvedelik eemaldada paberkäterätiga väga kergelt alusklaasile vajutades • Küünelakk panna katteklaasi (ümmargune) servadele, mitte peale. See ei lase vedelikul ära aurata ja preparaat püsib paigal.

13. Fluorestsentsi põhimõte

14. Hoescht 33258 neeldumis- ja emissioonispekter Alexa Fluor 488 ergastus- ja emissioonispekter Alexa Fluor 594 ergastus- ja emissioonispekter