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1. MICROBIOLOGIA – AULA 7 Legionella, Neisseria e Moraxella catarrhalis • QUESTÕES PARA AS PROVAS; • CONTEÚDO DAS AULAS; • ATIVIDADES ON-LINE; BLOG: http://chicoteixeira.wordpress.comchico.m.teixeira TWITTER: @ChicoMTeixeira MSN: ft.martins@hotmail.com e-mail: ft_martins@yahoo.com

2. Legionella Antecedentes históricos; Durante o verão de 1976, ocorreu um surto explosivo de pneumonia de etiologia desconhecida entre pessoas que participavam de uma convenção da American Legion, nos Estados Unidos; A doença multissistêmica (também incluiu pneumonia) que ocorreu nos indivíduos foi denominada doença dos legionários; Foram documentados 182 casos, 29 desses pacientes faleceram;

3. Legionella Antecedentes históricos; No início de janeiro de 1977, o agente etiológico foi isolado pelo Dr. Joseph McDade, do Centers for Disease control (CDC); Assim, em apenas 6 meses, foi desvendado um importante mistério médico, e foi descoberta uma nova família de bactérias, as Legionellaceae;

4. Taxonomia e Características Várias das espécies recentemente descritas são parasitas intracelulares obrigatórios de amebas de vida livre e só podem ser isoladas mediante co-cultura das amebas; As espécies de Legionella são bacilos gram-negativos não formadores de esporos e estreitos, de 0,3 a 0,9 mm de largura; São habitualmente curtas e delgadas ou cocobacilares quando examinadas em esfregaços diretos de amostras clínicas, porém o seu comprimento é mais variável após crescimento em meios de cultura, quando formas com mais de 20 mm não são incomuns; Quanto ao seu comprimento, as bactérias variam desde formas curtas, de 1,5 a 2 mm de comprimento, a formas filamentosas mais longas;

5. Taxonomia e Características Com a exceção de três espécies que carecem de motilidade, as demais espécies de Legionella são móveis e utilizam um ou mais flagelos polares ou subpolares; As Legionellaceae são aeróbicas e necessitam de condições especiais de acesso a nutrientes, ou seja, são nutricionalmente exigentes. Para o seu crescimento necessitam de L-cisteína e sais de ferro;

6. Taxonomia e Características O meio de crescimento ideal consiste numa variação do ágar carvão ativado-extrato de levedura. O extrato de levedura fornece os nutrientes necessários e o carvão ativado remove os radicais de oxigênio tóxicos produzidos pela exposição de muitos meios de cultura à luz; O tampão ACES possui pK de 6,9, um valor ótimo para o crescimento de Legionella spp. A adição do tampão ACES e de a-cetoglutarato produz o ágar BCYEa;

7. Taxonomia e Características O crescimento em ágar BCYEa e a sua ausência em ágar sangue constituem um dos indícios presuntivos mais úteis de que o microrganismo isolado pode ser uma espécie de Legionella;

8. Taxonomia e Características Outro microrganismo gram-negativo que cresce em BCYE é Francisella tularensis; Porém, ao contrário das espécies de Francisella, que produzem ácido a partir de carboidratos, as espécies de Legionella não fermentam nem oxidam carboidratos; Além disso, certos bacilos formadores de esporos termofílicos e Bordetella pertussis são capazes de crescer em ágar BCYEa;

9. Taxonomia e Características As espécies de Legionella são, em sua maioria, fracamente positivas para catalase e peroxidase; O teste de hidrólise do hipurato de sódio, que é positivo para L. pneumophila e negativo para a maioria das outras espécies de Legionella é um procedimento útil para diferenciação; Expression of kinetics of tyrosine phosphoproteins was analyzed by immunofluorescence in MRC-5 cells infected with virulentL. pneumophila and nonpathogenic laboratory strain E. coli HB101. Os testes bioquímicos tem apenas valor limitado para a identificação presuntiva. Entretanto, a sorotipagem de isolados é muito útil; Susa M , and Marre R Infect. Immun. 1999;67:4490-4498

10. Espectro clínico e patológico da Legionelose A doença dos legionários é esporádica, na forma de pneumonia adquirida na comunidade, mas também pode ocorrer como epidemias; Além da doença dos legionários, observa-se uma forma discreta da doença, denominada de febre de Pontiac; A doença também pode acometer outras regiões além da cavidade torácica;

11. Espectro clínico e patológico da Legionelose Assim, o termo legionelose, que inclui a doença dos legionários, a febre de Pontiac e problemas extrapulmonares por espécies de Legionella, é utilizado para qualquer infecção causada por bactérias da família Legionellaceae; Cerca de 85% dos casos documentados de legionelose foram causados por L. pneumophila; As espécies não-pneumophila mais frequentes foram L. longbeachae e L. bozemanii;

12. Tratamento A taxa de mortalidade observada entre pacientes com legionelose tem variado de 0 a 30% de acordo com o contexto clínico e da população de pacientes; A eritromicina tem sido efetiva para reduzir a taxa de mortalidade e, historicamente, tem sido o fármaco de escolha para a legionelose; A taxa de mortalidade correlaciona-se com a demora na instituição da terapia com a eritromicina;

13. Neisseria Antecedentes históricos; A gonorreia foi reconhecida na época de Galeno (século II d.C.), que a denominou com as palavras gregas gonor (“esperma”) e rhoia (“fluxo”), sugerindo que a doença estava relacionada com o fluxo de sêmen; Referências a essa infecção também foram encontradas na Bíblia e em histórias escritas de várias culturas; Embora já fosse reconhecida como uma doença sexualmente transmissível (DST) no século XIII, a gonorreia só foi diferenciada da sífilis no século XIX;

14. Neisseria Antecedentes históricos; Em 1879, Neisseria gonorrhoeae, o agente etiológico da gonorreia, foi visto pela primeira vez em exsudatos purulentos provenientes do trato genital e das conjuntivas por Albert Neisser, na Universidade de Breslau, Alemanha; O isolamento subsequente do microrganismo, a inoculação em animais e o reisolamento do microrganismo por Bumm em 1885 forneceram a relação causal entre o microrganismo e a doença; A meningite cerebrospinal epidêmica foi descoberta no início do século XIX; contudo, o agente etiológico não foi descrito até 1884, quando Marchiofava e Celli observaram o microrganismo em exsudatos meníngeos; Em 1887, Weichselbaum isolou o microrganismo, agora denominado Neisseria meningitidis, em cultura pura e descreveu pela primeira vez suas características e papel etiológico em seis pacientes com meningite aguda;

15. Taxonomia e Características Os microrganismos do gênero Neisseria são gram-negativos cocoides ou em formato de bastonetes que frequentemente ocorrem em pares ou em cadeias curtas; As espécies de diplococos têm laterais achatadas, fornecendo-lhes o aspecto de “grão de café”; Todas as espécies no gênero Neisseria habitam as superfícies mucosas dos hospedeiros de sangue quente. Esses microrganismos são imóveis, não formam esporos e crescem em 35 a 37ºC;

16. Taxonomia e Características Os microrganismos são capnofílicos, e crescem melhor em ambiente úmido. As espécies de Neisseriaproduzem ácido a partir da oxidação de carboidratos, e a produção de ácido integra a identificação de referência dessas espécies; Todas as espécies são oxidase-positivas e com algumas exceções são catalase-positivas; A maioria das espécies humanas de Neisseria é habitante normal das vias respiratórias;

17. Taxonomia e Características No laboratório clínico, o uso de meio enriquecido e de incubação de culturas em CO2 a 5-7% preenche as necessidades para isolamento desses microrganismos das amostras clínicas;

18. Taxonomia e Características Espécies de Neisseria patogênicas possuem vários fatores e características que constituem a virulência; Cepas de N. meningitidis isoladas de infecções graves possuem, em geral, cápsulas externas à membrana externa na superfície das células; Os gonococos e os meningococos também têm uma protease para imunoglobulina A (IgA1) capaz de quebrar IgA1 em fragmentos Fab e Fc;

19. Taxonomia e Características A neutralização de IgA1 e de seus efeitos, anulam a resistência da superfície de mucosa à infecção; Neisseria

20. Taxonomia e Características Condições nutricionais e atmosféricas também contribuem para a virulência de gonococos e meningococos; A colonização e a subsequente infecção das superfícies mucosas por esses microrganismos exigem ferro e ambos têm métodos enzimáticos que o torna disponível para a célula bacteriana; As cepas de N. gonorrhoeae são capazes de crescer anaerobicamente na presença de nitrito como um aceptor de elétrons;

21. Taxonomia e Características Nessas circunstâncias, também são expressas novas e diferentes proteínas da membrana externa; Essa propriedade pode contribuir para a virulência dos gonococos ao permitir que o microrganismo prolifere em um meio anaeróbico, como a endocérvice, o reto, o trato genital e a faringe, e também explicaria o importante papel desse microrganismo na doença inflamatória pélvica;

22. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae O diagnóstico de uretrite gonocócica nos homens adultos é estabelecido pela observação de diplococos gram-negativos estreitamente associados aos leucócitos polimorfonucleares em um esfregaço preparado a partir de secreção uretral; A coloração de Gram, quando adequadamente realizada, apresenta sensibilidade de 90 a 95% e especificidade de 95 a 100% para o diagnóstico de gonorreia genital em homens sintomáticos;

23. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae

24. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae Nas mulheres, a coloração de Gram de amostras endocervicais coletadas sob visualização direta da cérvice (com um espéculo) também pode ser muito útil para estabelecer o diagnóstico;

25. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae Os esfregaços dessas amostras coradas pelo Gram apresentam sensibilidade de 50 a 70%, dependendo da adequação da amostra e da população de pacientes; Nos pacientes com proctite sintomática, os esfregaços coletados sob visualização direta através de um anoscópio podem estabelecer o diagnóstico em 70 a 80% dos pacientes;

26. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae Os esfregaços com coloração de Gram não são úteis para estabelecer o diagnóstico de infecções gonocócicas faríngeas; Não se deve confiar apenas nos esfregaços de coloração Gram para estabelecer o diagnóstico de gonorreia, e devem ser utilizados outros testes mais específicos;

27. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae Existem vários meios seletivos enriquecidos para cultura de N. gonorrheae e incluem Thayer-Martin (MTM) modificado, meio Martin-Lewis (ML), meio GC-Lect e meio New York City (NYC). ML e GC-Lect são meios baseados em ágar chocolate que são suplementados com fatores de crescimento para microrganismos exigentes; Esses meios contêm agentes antimicrobianos que inibem outros microrganismos;

28. Isolamento de espécies de Neisseria gonorrhoeae

29. Tratamento da gonorreia Logo após a sua descoberta na década de 1940, a penicilina passou a ser o tratamento de escolha para a gonorreia e durante a década de 1950 até meados da década de 1970, os esquemas terapêuticos foram atualizados para acompanhar o aumento da resistência contra a penicilina e outros agentes (tetraciclina e macrolídeos); Devido ao aumento da resistência contra os agentes antimicrobianos mencionados e com base em várias provas de eficácia clínica:

30. Tratamento da gonorreia Recomenda-se que todos os pacientes com infecção gonocócica não-complicada recebam um dos cinco esquemas terapêuticos em uma única dose:

31. Isolamento de espécies de Neisseria meningitidis Nos esfregaços corados pelo Gram preparados a partir de amostras clínicas, sobretudo o líquido cefalorraquidiano, os meningococos aparecem como diplococos gram-negativos dentro e fora do PMN; Como a presença de células inflamatórias tem valor prognóstico (p. ex., com doença fulminante rapidamente fatal são observados muito microrganismos e poucas células inflamatórias);

32. Isolamento de espécies de Neisseria meningitidis O relato da coloração de Gram para o médico deve incluir a quantificação dos microrganismos e dos PMN; Além da coloração de Gram e da cultura do CSF, o laboratório também pode realizar testes para a detecção direta de antígenos polissacarídicos capsulares meningocócicos; Os testes diretos utilizam aglutinação de látex;

33. Isolamento de espécies de Neisseria meningitidis Embora os testes positivos com esses reagentes sejam úteis para estabelecer o diagnóstico precoce, um teste negativo não descarta a possibilidade de meningite causada por qualquer um dos agentes comuns; Esses testes sempre devem ser realizados junto com a coloração de Gram e cultura em meio de ágar enriquecido;

34. Isolamento de espécies de Neisseria meningitidis Para o isolamento de N. meningitidis as amostras de CSF devem ser cultivadas em ágar chocolate não-seletivo e ágar sangue de carneiro, enquanto as amostras que podem abrigar outros agentes devem ser inoculadas em meios seletivos (p. ex., Martin-Lewis ou ágar GC-Lect; As placas são incubadas em CO2 a 5-7% a 35ºC e inspecionadas 24, 48 e 72 horas antes do relato final de “ausência de crescimento”;

35. Tratamento da meningite meningocócica Apesar do isolamento ocasional de cepas de N. meningitidis com sensibilidade reduzida à penicilina, a penicilina G ainda é o fármaco de escolha nos EUA para o tratamento da meningite meningocócica; No Brasil, a ceftriaxona é um dos antibióticos mais utilizados, sendo que a penicilina em altas doses demonstra ser muito eficiente, em alguns casos o cloranfenicol poderá ser usado;

36. Moraxella catarrhalis Importância Clínica: Durante os últimos 10 anos, o agente patogênico outrora denominado “Neisseria catarrhalis”, a seguir “Branhamella catarrhalis” e agora Moraxella catarrhalis recebeu muita atenção como patógeno humano emergente; Antes de 1990, acreditava-se que M. catarrhalis fizesse parte da microbiota normal do trato respiratório superior; O isolamento mais frequente desse microrganismo no trato respiratório de crianças e idosos com doença respiratória crônica fundamenta sua participação em determinadas infecções da infância e nas infecções do trato respiratório inferior nos idosos;

37. Moraxella catarrhalis Importância Clínica: As infecções do trato respiratório e das áreas anatômicas adjacentes representam a maioria das condições clínicas que envolvem Moraxella como agente etiológico; Estudos in vitro revelaram que algumas cepas de M. catarrhalis mostram maior aderência às células epiteliais da nasofaringe de crianças propensas a otite do que às células de crianças não propensas a otite; Essas infecções incluem otite média, sinusite, bronquite e pneumonia;

38. Isolamento de Moraxella catarrhalis M. catarrhalis cresce bem em ágar sangue e em ágar chocolate, e algumas cepas crescem bem em meio Thayer-Martin modificado e em outros meios seletivos; As colônias apresentam, em geral, coloração cinza e branca, são opacas e lisas; M. catarrhalis pode ser diferenciado de Neisseria por sua capacidade de hidrolisar grupos butirato ligados à ester (butirato esterase);

39. Sensibilidade de M. catarrhalis a antimicrobianos O aparecimento e a disseminação da resistência aos agentes antimicrobianos entre Neisseria patogênica também se refletem na sensibilidade de isolados de M. catarrhalis; No laboratório clínico, as cepas de M. catarrhalis devem ser avaliadas quanto à produção de b-lactamase; Vários estudos indicam que M. catarrhalis são suscetíveis a:

40. Sensibilidade de M. catarrhalis a antimicrobianos macrolídeos

41. Muito Obrigado!!!