A(H1N1) 流感病毒感染的实验室诊断

1. A(H1N1)流感病毒感染的实验室诊断 铜川矿务局中心医院 秦银虎

2. Four-year-old Edgar Hernandez (L) who has recovered from the A/H1N1 flu influenza recently, and his mother rest in a free dining room at his hometown in Veracruz state in Mexico May 2, 2009. Hernandez is the first patient who was infected by the A/H1N1 flu influenza in Mexico. (Xinhua Photo)

3. A( H1N1)确诊病例报告累积数（至2009-05-10，07：30GMT）29国 国家 病例数 死亡数 国家 病例数 死亡数 阿根廷 1 澳大利亚 1 奥地利 1 巴西 6 香港 1 哥伦比亚 1 丹麦 1 萨尔瓦多 2 法国 12 德国 11 危地马拉 1 爱尔兰 1 以色列 7 意大利 9 日本 4 荷兰 3 新西兰 7 巴拿马 3 波兰 1 葡萄牙 1 韩国 3 西班牙 93 瑞典 1 瑞士 1 英国 39 美国 2554 2 墨西哥 1626 45 加拿大 280 1 哥斯达黎加 8 1 共计 4379 49

4. 流感大流行警戒级别由4级提高到5级April 29, 2009 • 第5级的特点是，病毒的人际传播发生在一个世卫组织区域的至少两个国家中。虽然在此阶段大多数国家不会受到影响，但宣布第5级是一个强烈的信号，表明大流行迫在眉捷，敲定计划缓解措施的组织、交流和实施已经时不我待。

5. 没有报告在动物中流行\已知家养或野生动物中流行的动物流感病毒导致了人类感染\动物或人类—动物流感重组病毒在人群中造成了零星病例或小规模传染没有报告在动物中流行\已知家养或野生动物中流行的动物流感病毒导致了人类感染\动物或人类—动物流感重组病毒在人群中造成了零星病例或小规模传染 病毒的人际传播发生在一个世卫组织区域的至少两个国家中\其特点是除了第5级确定的标准外，在世卫组织一不同区域至少其他一个国家发生了社区层面的暴发 社区层面暴发

6. 中华人民共和国卫生部公 告2009年 第 8号 • 经国务院批准，现公告如下： • 一、将甲型H1N1流感（原称人感染猪流感）纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。 • 二、将甲型H1N1流感（原称人感染猪流感）纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。 • ……2009-4-30

7. 卫生部办公厅关于进一步加强甲型H1N1流感密切接触者所在地区防控工作的通知卫生部办公厅关于进一步加强甲型H1N1流感密切接触者所在地区防控工作的通知 • 从5月3日起，对甲型H1N1流感密切接触者实施隔离观察情况实行日报告和零报告制度，各地要在每日9时前将前日工作情况报我部。 • ……

8. Influenza A(H1N1) • 30 April 2009 -- From today, WHO will refer to the new influenza virus as influenza A(H1N1).

9. 新的A(H1N1)病毒亚型 • 据称这一病毒是从未在猪或人群中发现的甲型H1N1流感病毒的一个新亚型 • 其含有某些北美猪流感、北美禽流感、一个人流感和两个欧亚猪流感病毒基因片段 1918 1976 2009

10. 流感病毒株的命名 • 流感病毒株的命名应包括病毒型别、分离地点、分离点的顺序编号、分离年份以及HA和NA的抗原性质。来自动物的甲型流感病毒分离株，还应加上动物名称 • 例如：A/菲律宾/2/82（H3N2） A/台湾/1/86（H1N1） A/海豹/马萨诸塞州/1/70（H7N7）

11. 甲型流感病毒 • 甲型流感病毒颗粒由8个RNA片段和蛋白质外壳组成 • 病毒外壳含有来自宿主细胞的脂质，其表面有刺样突起，长约10-14nm，直径约4-6nm，主要由HA和NA组成 • 流感病毒A所有亚型可感染海鸟和水禽。感染后多无症状且局限于消化道或呼吸道 • 另外，家禽、猪、海洋哺乳动物、马以及偶尔其它哺乳动物可被特定亚型病毒感染

12. 猪流感病毒 • 感染猪的有：H1N1，H1N2,H3N2,H3N1，H9N2，H5N1及禽与哺乳类甲型流感病毒基因重配株 • 感染人的有：H5N1，H7N7，H7N2，H7N3和H9N2毒株 • 引起禽流感的主要为H5，H7和H9亚型中的一些毒株 • 感染其他动物的有：马-H3 N8亚型毒株；海豹-H7N7，H4N5，H4N6和H3N3；鲸-H1N3，H13N2和H13N9；水貂-H10N7

13. INFLUENZA VIRUS STRUCTURE AND VIRION HA RNP NA ENVELOP MATRIX PROTEIN M1

14. 流感病毒对外界环境抵抗力较强 • 病毒粒的感染性在粪便中可维持一周，4-8℃水中可维持一个月 • 对热较稳定，如A/火鸡/威斯康辛1/66（H9N2）毒在56℃条件下灭活30min仍具有感染性 • 较耐酸，在pH4.0条件下，具有一定的抵抗力

15. 流感病毒的抗原漂移和抗原转变 • 抗原漂移是亚型内的变异，属于较小的变异；抗原转变是新亚型的出现，是较大的变异 • 甲型流感病毒容易发生抗原转变，常可引起大的流行。乙型流感病毒变异较慢，可导致局部流行；而丙型流感病毒未见变异，常呈散发流行

16. 抗原漂移发生的机理 • 主要是HA蛋白基因一系列点突变的累积导致了氨基酸序列改变的累积，改变了HA蛋白分子上的抗原位点 • 其次由于序列出现缺失和插入所造成，但不多见 • 分子内重组，这在分节段的负链病毒中是罕见的。但近来发现，细胞的mRNA插入到病毒HA基因，病毒获得了毒力 • 流感病毒的抗原性变异经常不断地发生

17. 流感病毒大流行株的起源抗原性转变 • 基因重配(Genetic reassortment)学说 认为流感病毒大流行株是人和动物流感病毒通过基因重配而来 • 如1957年出现的H2N2亚型毒株的3个基因节段(HA， NA和PBl)来自禽的流感病毒，而其余5个基因节段来自人的HlNl亚型毒株 • 再如1968年出现的H3N2亚型毒株的两个基因节段(HA和PBl)来自禽的流感病毒，而其余6个基因节段来自人的H2N2亚型毒株

18. 流感病毒大流行株的起源抗原性转变 • 流感病毒基因具有严格的宿主特异性，那么人与禽流感病毒在自然条件下如何发生基因重配? • 一些人认为可能性最大的是猪，因猪既能被禽又能被人流感病毒所感染，人与禽流感病毒在猪体内重配后形成新亚型流感病毒，然后传到人。这种看法是否正确，仍需得到事实所证实

19. Illustration here shows reassortment of viral RNA segments in a cell infected by two strains of influenza virus Bird flu H5N1 leading to a new and potentially dangerous strain that could spread easily from human to human and so trigger a deadly worldwide epidemic

20. Bird flu and human flu entering the same cell and the emergence of a new strain (pandemic) of influenza virus

21. Flu Virus infecting a person

22. 关于A(H1N1)病毒的流行性 • 正常情况下，猪流感病毒具有种的特异性，只感染猪。在某些情况下，病毒亦可穿越屏障引起人类疾病 • 国际卫生条例实施后有记录的病例（07） 1976 Fort Dix,NJ,US 4(1) 士兵 1988 1 32岁健康孕妇，有暴露史 2005-09 12 其中： 5例有猪暴露史 6例与猪群很近 1例不详

23. 关于A(H1N1)病毒的流行性 • 季节性流感主要感染年幼者和老人，而本次流行的H1N1甲型流感病毒可感染所有年龄段的人群，但在墨西哥大多数感染发生在4-45岁的健康年轻人群中 • 传播途径： 通过感染者的咳嗽或喷嚏等经呼吸道传播； 通过触及带有流感病毒的物品然后触摸口鼻而感染

24. 关于A(H1N1)病毒的流行性 • 流感患者的排毒期 • 流感病毒在呼吸道纤毛的柱状上皮细胞内繁殖，引起细胞坏死、脱落，排毒高峰出现在发病前1天到不发热的一段时间，一般设定为在发病后7天内有传染性 • 婴儿、免疫力低下者其排毒期可能延长

25. 人感染猪流感的实验室诊断

26. 人感染猪流感的诊断标准 符合下列情况之一即可诊断为疑似病例： • 1.发病前7天内与甲型H1N1流感疑似或确诊病例有密切接触（在无有效防护的条件下照顾患者，与患者共同居住、暴露于同一环境，或直接接触患者的气道分泌物或体液），出现流感样临床表现。 • 2.发病前7天内曾到过甲型H1N1流感流行（出现病毒的持续人间传播和基于社区水平的流行和暴发）的国家或地区，出现流感样临床表现。 • 3.出现流感样临床表现，甲型流感病毒检测阳性，但进一步检测排除既往已存在的亚型。

27. 人感染猪流感的诊断标准 确诊病例 出现流感样临床表现，同时有以下一种或几种实验室检测结果的： • 1．甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性（可采用real-time RT-PCR和RT-PCR）。 • 2.分离到甲型H1N1流感病毒。 • 3.血清甲型H1N1流感病毒的特异性中和抗体水平呈4倍或4倍以上升高。

28. A（H1N1）实验室检测 确诊方法 • RT-PCR • 病毒分离培养 • 血清特异性中和抗体滴度测定 筛查方法 • 抗原快速检测

29. A（H1N1）实验室检测 病毒培养、抗原或核酸检测标本采集 • 临床标本应早期采集，最好采集发病3天内的标本 • 鼻、咽拭子标本（单独或同时）、鼻咽抽取物、以及鼻腔洗液 • 痰标本 • 支气管肺泡灌洗液及气管抽吸液

30. A（H1N1）实验室检测 病毒培养、抗原或核酸检测标本采集 • 应使用具有铝质或塑料杆的拭子，其前端采样头应为合成材料，如聚酯或涤纶的拭子采集标本 • 不可采用棉质头和木质杆的拭子采集标本，也不可采用藻酸钙拭子

31. A（H1N1）实验室检测 病毒培养、抗原或核酸检测标本拒收标准 • 未在2-4℃保存的标本（≤4天） • 没有在-70℃或更低温度冷冻保存的标本 • 前述标本类型以外的其他标本

32. A（H1N1）实验室检测 病毒培养标本保存 • 为稳定病毒的感染性，须将临床标本置于适当的转运培养基中。如：胰蛋白磷酸肉汤、牛肉浸汤、细胞培养液或HANKs平衡盐溶液、蔗糖磷酸缓冲液等 • 添加0.5%牛血清白蛋白或0.1%明胶，以及抗菌素和抗真菌素等抗菌素： 青霉素2×106U/l 链霉素200mg/l 多粘菌素B 2×106U/l 庆大霉素250mg/l 制霉菌素0.5×106U/l 氧氟沙星60mg/l 磺胺甲噁唑0.2g/l

33. A（H1N1）实验室检测 标本转运 • 转运培养基中的标本在4℃保存，并应立即于冷藏状态送往实验室 • 标本在采集后3-4天内不能进行处理则应置-70℃保存 • 如通过荧光抗体染色检测脱落上皮细胞中的病毒抗原进行感染的诊断则应立即转运并处理标本

34. A（H1N1）实验室检测 血清标本采集 • 急性期血清标本在发病后立即采集，最迟不超过7天 • 恢复期血清标本应在发病后2-4周采集 • 单份血清不能进行个体诊断 • 分离血清保存在-20℃

35. 央视网消息(新闻联播5月1日播出) • 4月27日，从美国CDC获得病毒序列后，中国疾控中心立即进行了病毒基因序列比对、核酸检测技术的设计和测试，经过60多个小时不眠不休，于昨天研制成第一代检测试剂。 • 中国疾控中心今天紧急组织我国流感监测实验室的疾控专家学习甲型H1N1流感病毒的检测方法。 • 今天下午，在病毒病预防控制所，30多名以重点口岸城市为主的疾控专家参加了检测方法的第一期培训。中国疾控中心昨晚已经向遍布全国的84个流感检测实验室分发这种检测试剂。

36. A（H1N1）实验室检测 • 实时RT-PCR，设计有三组引物和相应的探针： • InfA用于检测甲型流感病毒 • swInfA用于检测甲型猪流感病毒 • swH1用于特异性地检测猪H1型流感病毒

37. A（H1N1）实验室检测 • 实时RT-PCR----防止污染 • 有独立的核酸提取实验室 • 有适当的、定点使用的仪器和耗材，如加样枪、离心机、微量离心管、枪头等 • 在实验时穿戴洁净的工作服、无粉末的新手套 • 处理不同的标本之间更换手套，或在手套被污染时更换之 • 试剂和反应管应尽可能加盖

38. A（H1N1）实验室检测 • RT-PCR试验设有： 无模板对照-空白对照 用于监测试验的特异性，当有假阳性发生时表明标本污染 人标本对照-阴性对照 用于监测核酸提取过程与试剂组配过程的污染可能，阳性时说明RNA提取过程的污染，或样本间的交叉污染

39. A（H1N1）实验室检测 RT-PCR试验设有： • 阳性对照 用于监测试验的特异性，当有假阴性发生时表明本次试验失败 • 针对RNaseP基因的内设阳性对照 本对照在37个循环前应阳性，表明标本中有足够量的人RNaseP的RNA存在，标本质量可以接受

40. A（H1N1）实验室检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA B swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA C swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 D RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP E InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA InfA F swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA swInfA G swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 swH1 H RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP RP 阴性对照 阳性对照 人标本对照

41. A（H1N1）实验室检测 • RT-PCR局限性 • InfA、swInfA、swH1三者均阳性时，可报告阳性反应，当 InfA阳性，而亚型检测只有一个阳性，或者仅有时InfA阳性，不能确定诊断 • 在标本中微生物量少时，可有假阴性发生 • 当模板DNA/RNA超量时，可有假阴性发生

42. A（H1N1）实验室检测 病毒分离实验室应满足下述基本条件 • 实验室装备有能维持定向气流的通风系统 • 废气不应在实验室内循环，否则应经HEPA滤过；排出实验室外的废气，应远离所在的建筑物和进气口。废气亦可经HEPA过滤后排出 • 工作时限制人员进入

43. A（H1N1）实验室检测 病毒分离实验室应满足下述基本条件 • 严格执行三级生物安全实验室的操作建议（WHO,实验室生物安全手册，三版） • 实验室工作人员应穿着防护装备：包括一次性手套、前封式或全封式防护服、scrub suits,帽子、鞋套、防护眼镜或面罩、呼吸保护装置如N95口罩或更高级别的保护装置

44. A（H1N1）实验室检测 病毒分离实验室应满足下述基本条件 • 良好的洗手设施 • 离心应使用密封的离心机转子或样品杯；转子或离心杯应在生物安全柜内装载或取出 • 所有在实验室内或实验室间转运的物质均应置于另一二级容器内，以防止破裂和溅出 • 自生物安全柜内取出样本应进行表面消毒

45. A（H1N1）实验室检测 • A型流感病毒快速抗原检测：可用于检测该病毒，但由于和其它检测方法相比灵敏度较低，因此，可能会导致假阴性结果 • 免疫荧光和其他免疫检测方法：由于使用的抗体可能不会和该病毒的靶位点结合，因此，会产生假阴性结果

46. A（H1N1）实验室检测 快速抗原检测 • 检测呼吸道标本中季节性甲型和乙型流感病毒的核蛋白抗原 • 推测可用于A(H1N1)病毒抗原的检测 • 其在季节性流感病毒抗原检测中的敏感性约为50-70%，特异性约为90-95%，对于A(H1N1)的检测没有相关资料可以参考

47. A（H1N1）实验室检测 快速抗原检测 • 乙型流感病毒抗原阳性反应表示乙型流感病毒感染或假阳性反映，患者患甲型流感的可能性小 • 甲型流感病毒抗原阳性反应表示患者可能感染新型A（H1N1）；甲型流感病毒季节性感染；假阳性

48. A（H1N1）实验室检测 • 快速抗原检测 • 阴性反应，不能排除新型A（H1N1）病毒感染。如患者与确诊病例有流行病学联系，或者曾到过或居住在有确诊病例的社区则应根据临床进行进一步的实验室检查和治疗；如患者没有相应的流行病学史且病情较轻，则不建议做进一步检查

49. A（H1N1）实验室检测 外周血象： • 白细胞总数一般不高或降低。

50. A（H1N1）实验室检测 • A（H1N1）实验室检测的生物安全 • 所有疑似病例患者的临床标本进行处理和诊断性检测，应在BSL2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜内进行 • 另外，应根据特定场所的风险评估，配备个人防护装备：N95口罩或更高级别的呼吸防护装备、鞋套、前封式手术服、双层手套、护目镜或面罩