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TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA. Lunes. TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS. 1. Observación en fresco Son preferibles en las situaciones siguientes: La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen. Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad

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TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

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Presentation Transcript

  1. TECNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCOPICA

  2. Lunes TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS • 1. Observación en fresco • Son preferibles en las situaciones siguientes: • La morfología de las bacterias se altera cuando se desecan y tiñen. • Cuando las bacterias se observan para determinar movilidad • Para observar los cambios citológicos que ocurren durante la división celular • Por este método se observan fácilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasa. • 2. Observación con tinciones • Para observar las características morfológicas de las bacterias • Identificación y diferenciación de microbios entre especie y dentro de la misma especie (tinción diferencial o selectiva).

  3. Lunes TIPO DE OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS • 1. Observación en fresco • preparación en fresco simple • preparación en gota pendiente • 2. Observación con tinciones • Tinción simple: un solo colorante. • Tinción diferencial: más de un colorante • Tinción especial • Tinción negativa: colorea el medio que rodea a la bacteria permaneciendo ésta sin teñir. 

  4. 1. Colocar una gota de SSF o agua en un porta 2.- Tomar la muestra con el asa de siembra o un gotero Procedimiento para un preparado en fresco ("entre porta y cubre") Muestra Porta objeto

  5. Observación microscópica • Observación en fresco • Bacterias: Leptospiras, treponemas (M. campo oscuro)

  6. Observación microscópica • Observación en fresco : (SSF) • Parásitos : Trofozoitos, larvas.

  7. Observación microscópica • Observación en fresco • Hongos: Levaduras

  8. Observación microscópica 1. Observación en fresco con modificaciones • Hongos • NaOH 10% (hifas)

  9. Procedimiento para un preparado en fresco en gota pendiente

  10. 2. TINCIONES O COLORACIONES

  11. COLORANTE: DEFINICIÓN • Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente. • Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste

  12. COLORANTES: Tipos a) Sales colorantes: más comúnmente usados • básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Tiñen la célula bacteriana uniformemente (ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos ) • (cromatina nuclear de pro y eucariotas) • (más usados en citología bacteriana). • Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta • ácidos: Tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado.No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste (coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas(Rx básicas) • Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo.

  13. COLORANTES: Tipos b) Colorantes liposolubles • Se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usados para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán.

  14. COLORACIONES : Tipos • Vitales • Son aquellas que se practican sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. • Ejem: el verde Jano y el azul de metileno. • Supravitales • son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos, pero que están aislados del organismo del que proceden. • No vitales • se realizan sobre células muertas.

  15. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA • Frotis o película (extensión) • La fijación • Coloración.

  16. Tinción de células para la observación microscópica Extensión de una fina capa de células sobre el porta Adición del colorante lavado y secado Secado al aire Se coloca una gota de aceite de inmersión sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X Fijación por flameado del porta

  17. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA • Frotis o película (extensión) • Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados

  18. Metanol TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA b) La fijación: Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas) TIPOS • CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH) • FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter)

  19. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA c) Coloración. SIMPLE : Positiva o negativa

  20. Frotisy fijación 3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1.- Poner una gota de agua en un porta 2.- Tomar la muestra con el asa de siembra Tinción 2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio 1.- Cubrir la preparación con Azul de Metileno 5’ Micrococcus luteus Tinción simple de azul de metileno. Lunes

  21. 1.- Colocar una gota de Nigrosina en un porta 2.- Tomar muestra del microorganismo con el asa, flamear el tubo y tapar 3.- Mezclar con la Nigrosina y extender por todo el porta. Secar al aire y observar Lunes Tinción negativa. cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas

  22. Hongos • Tinción negativa

  23. TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIÓN COLOREADA c) Coloración. Diferencial o compuesta se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos Etapas: 1. tinción primaria 2. Tinción de contraste o secundaria • Ejemplo.: COLORACION GRAM, COLORACION DE ZIEHL- NEELSEN, ESPORAS

  24. TERMINOS • Los mordientes, aunque no son colorantes, intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.

  25. Diferencias en la pared celular

  26. 6.- Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio 4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ Lunes Tinción L-3.2.3.- Tinción de Gram Frotis y fijación 1.- Poner una gota de agua en un porta 2.- Tomar la muestra con el asa de siembra 3.- Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1.- Cubrir la preparación con Cristal Violeta 2’ 2.- Añadir Lugol (mordiente) durante 1’ 3.- Decolorar con Alcohol 96º hasta que no suelte colorante

  27. Tinción de Gram Tinción del frotis Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las células se tiñen de color azul-violeta. Paso 1 Añadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las células siguen de color azul-violeta. Paso 2 Gram + Decolorar con alcohol Las células Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran. Paso 3 Tinción de contraste Con safranina 2 minutos. Las células G+ se ven azul-violeta. Las G- rosas o rojas. Paso 4 Gram -

  28. PROCEDIMIENTO COLORACION GRAM

  29. Lunes Tinción de Gram Cocos Gram - Bacilos Gram -

  30. COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN fundamento de esta técnica diferencial se basa en la propiedad de la pared celular Orden Actinomycetales. (acidos micólicos) • Resiste la decoloración con alcohol y un ácido fuerte cuando • VARIANTES • Caliente : Mycobacterium • En frío (o de Kinyoun) : Cryptosporidium, Cyclospora E

  31. Frotis y fijación 3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1.-Poner una gota de agua en un porta 2.- Tomar la muestra de un cultivo de Mycobacterium 2.-Calentar con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero hasta la emisión de vapores. Mantener durante 5 minutos. 3.-Lavar con agua y decolorar con alcohol ácido 1.-Cubrir la preparación con Fuchina fenicada 5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio 4.-Teñir con Azul de Metileno 1’ Miercoles Tinción de ácido-alcohol-resistente. Tinción

  32. Tinción de esporas. Esporas Bacterias Miercoles Tinción Frotisy fijación 3.-Extender sobre el agua y fijar a la llama del mechero 1.-Cubrir la preparación con Verde Malaquita 1.-Poner una gota de agua en un porta 2.-Tomar la muestra de un cultivo de Bacillus 5.-Lavar con agua, dejar secar y observar al microscopio 3.-Lavar con agua 4.-Teñir con Safranina 1’ 2.-Calentar, con un hisopo de algodón empapado en alcohol y prendido con la llama del mechero, hasta la emisión de vapores. Mantener caliente durante 5 minutos.

  33. La tinción de flagelos de Leifson • 1.Se fija químicamente la suspensión bacteriana, mediante formol, y se hace la extensión en un portaobjetos. • 2.Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. • 3.Se cubre la preparación con una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina, de preparación extemporánea. El ácido tánico engruesa los flagelos y la rosanilina los tiñe. • 4.Se retira el exceso de colorante con agua.5. Por último, se deja secar al aire, antes de su observación al microscopio. 

  34. Figura 3.11Tinciones específicas. (a) La tinción de Wirtz-Conklin se utiliza para observar endosporas. Bacilius cereus (b) La tinción de Leifson revela que este microorganismo posee flagelos, lo cual contribuye a su identificación como Spirillum volutans..(c) La tinción negativa con tinta china permite observar que esta bacteria posee cápsula, lo que facilita su identiticación como Klebsiella pneumoniae, agente causal de la neumonía.

  35. Técnicas de tinción para bacterias

  36. Imágenes de Paramecium al mismo aumento (1000x), pero con distintos microscopios. (a) La microscopía de campo claro permite observar la forma y las estructuras internas de mayor tamaño, como el núcleo. (b)La imagen de contraste de fases muestra mayor detalle interno, y el característico halo. (c) La microscopía de campo oscuro revela la presencia de cilios. (d) La imagen de Nomarsky es casi tridimensional.

  37. PARASITOS: Plasmodium • GIEMSA O WRIGHT

  38. COLORACION LEISHMAN

  39. HONGOS • AZUL DE LACTOFENOL • T. MENTAGROPHYTES

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