ODPORNOST MEMBRANSKIH LIPIDOV NA DETERGENTE Mojca Brunskole

1. ODPORNOST MEMBRANSKIH LIPIDOV NA DETERGENTE Mojca Brunskole

2. Biološke membrane - modeli Davson in Danielli-jev model: dvosloj, sestavljen samo iz fosfolipidov, nevtralnih lipidov in glikolipidov ter membranskih proteinov, ki pokrivajo polarni površini dvosloja Singer in Nicholson-ov model tekočega mozaika: 1. amfifilni proteini se nahajajo znotraj lipidnega dvosloja 2. dinamičnost membrane - lateralna mobilnost membranskih komponent - debelina membrane se s časom spreminja

3. Modifikacije Singer-Nicholsonovega modela: membranski lipidi in proteini niso naključno razporejeni – določeni proteini se nahajajo znotraj manjših predelov membran → ojačanje protein-protein interakcij, pospešen prenos signalov in encimskih reakcij Hipoteza lipidnih raftov: - prehodne mikrodomene, obogatene s sfingolipidi in holesterolom ter specifičnimi proteini - vloga: membranski prenos, celično signaliziranje, imunski odziv, vstopno mesto za viruse in toksine, apoptoza + obstoj dveh tekočih lipidnih faz v dvosloju: tekoča-urejena (lo) faza (bogata s holesterolom) in tekoča-neurejena (ld) faza

4. DRM ≠ lipidni rafti • v zgodnjih študijah so domnevali, da so rafti in na detergente odporne membrane strukturno in shematično sorodni: 1. hipoteza: če se pri membrani, ki je pri 37°C popolnoma topna v prebitku Tritona X-100, pri 4°C pojavi v detergentu netopna frakcija, naj bi bila to DRM, ki je pri 37°C raft 2. hipoteza: DRM so bogate s sfingolipidi in holesterolom, ki se nahajajo tudi v lo-faznih domenah in lipidnih raftih

5. Lichtenberg D, Goni F M, Heerklotz H: TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 30, No. 8, Aug. 05, page 431

6. DRM (detergent-resistant mambranes) – rezultat nepopolnega raztapljanja membran z detergenti; umetno nastale strukture, ki v nativni membrani pred obdelavo z detergenti ne obstajajo • LIPIDNI RAFTI – nahajajo se v tekoči-urejeni (lo) fazi lipidnega sloja – se ne raztapljajo z detergenti; membranske domene, ki obstajajo tudi pred obdelavo z detergenti

7. DETERGENTI • amfifilni, spontana tvorba micelov • ↓ konc. detergentov: detergent je porazdeljen na meji med vodno fazo in lipidnim dvoslojem • ↑ konc. detergentov: mešani miceli detergent-fosfolipid • vpliv na raztapljanje membran: razmerje detergent/lipid, sestava membrane, vrsta uporabljenega detergenta, sestava vodnega medija, eksperimentalni pogoji (temp.) • mešani miceli detergent-lipid-membranski protein → izolacija membranskih proteinov

8. Lichtenberg D, Goni F M, Heerklotz H: TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 30, No. 8, Aug. 05, page 432

9. ODPORNOST LIPIDOV NA DETERGENTE • kljub ↑ konc. detergenta → netopne membranske frakcije • odpornost na detergente naj bi bila povezana z: - visoko urejenostjo acilnih verig v lipidnem dvosloju (lo faza, kar velja tudi za lipidne rafte) - visoko vsebnostjo sfingomielina (SM) in holesterola – rezistenca kot posledica interakcij med SM in holesterolom (H-vez med 3β- OH holesterola in karbonilno skupino SM) - temperaturo, viskoznostjo

10. VPLIV TEMPERATURE NA ODPORNOST NA DETERGENTE • za raztapljanje tekočih kristalnih dvoslojev je z naraščajočo temperaturo potrebna vedno večja količina detergentov – ↑ temperatura→ ↑ neurejenost hidrofobnih verig → ↓ spontano tvorbo micelov → za SM je znano: pri nižjih T količina detergenta potrebna za raztapljanje z naraščajočo temperaturo pada, pri višjih T pa narašča • temperatura vpliva tudi na CMC (kritična micelarna konc.) in porazdelitev micelov v vodnem mediju (pri 40°C je CMC minimalna, porazdelitev micelov pa maksimalna)

11. SPREMEMBE STRUKTURNIH DOMEN POD VPLIVOM Tritona X-100 (TR) • spremembe v tekoči-urejeni fazi se začnejo še preden je dosežena CMC detergenta • idealno: dodatek detergenta naj bi pospešil prehod urejenih domen v tekoče • dejansko: dodatek TR celo poveča število in urejenost urejenih domen; nastanek urejenih domen v predhodno homogenih strukturah (DRM) • koalescenca urejenih domen pod vplivom TR

12. VPLIV DETERGENTOV NA NASTANEK DRM • največ študij narejenih s Tritonom X-100 (↑ afiniteta do fosfatidilholina, ↓ do SM) • z različnimi detergenti lahko iz iste membrane pridobimo različneDRM – tako po velikosti, kot po vsebnosti lipidov in proteinov → dokaz, da se DRM razlikujejo od raftov tudi če bi na membrani obstajali različni tipi raftov, obstaja le majhna verjetnost, da bi jih lahko selektivno izolirali

13. POMEN EKSTRAKCIJE DRM • selektivnasolubilizacija membranskih komponent • zanimivo s stališča proučevanja celičnih membran • možnost proučevanja membranskih proteinov ter interakcij med lipidi in proteini