Cultivos Microbianos

1. Cultivos Microbianos Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, Noviembre 2005

2. Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos, la asimilación del C deriva de 8 intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato.

3. P qp qO2 O2 µ S qS qCO2 CO2 Conceptos básicos de cinética microbiana qivelocidad específica de consumo de sustrato o formación de producto (qimmol/ g biomasa x h ) rivelocidad volumétrica de consumo de sustrato o formación de producto ri( mmol/ litro x h ) ri= qi *X X concentración de biomasa V estado fisiológico de la célula (flujos metabólicos) rO2= qO2 * X Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades !

4. rx rsx rp rsp rsm rx , rp rs ,rO2 Rendimientos verdaderos y mantenimiento rs S d1 CH2O + α1 NH3 + β1 O2  g1 biomasa + δ1CO2 + w1H2O + Δh1 d2 CH2O + α2 NH3 + β2 O2  s2 producto + δ2 CO2 + w2H2O + Δh2 d3 CH2O + β3 O2  mantenimiento + δ3 CO2 + w3 H2O + Δh3 Rendimientos verdaderos rN NH3 rO2 O2 (d1+d2+d3) = d , (α1+ α2) =α , (β1+ β2+ β3) = β , (δ1+ δ2+ δ3) = δ, Si d=1 α=a, β=b, δ= yco2/s CH2O + a NH3 + b O2yx/s biomasa +yp/s producto + yco2/sCO2 + w H20 + Δh Rendimientos experimentales

5. Ecuación lineal de consumo de sustrato (ELCS) rp = 0 ms = 0.05 g glucosa / g biomasa x h µ (h-1)yx/s / y´x/s 0.05 0,645 0.1 0,78 0.3 0,92

6. Factores que afectan la velocidad de crecimiento (µ) • Temperatura • pH • øH2O • Composición del medio Ecuación de Monod µ = f(S) qs qi µ Sint Sext E membrana celular ≡ S (g/l) cultivo restricto cultivo irrestricto µ≠ f(S) Ks = ug a mg/l

7. Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana Crecimiento de Saccharomyces cereviseae El metabolismo de S cereviseae es netamente oxidativo hasta una µ de 0.2-0.25 h-1. Por encima de este valor se induce la fermentación alcohólica dando lugar a un metabolismo mixto oxidativo-fermentativo. El rendimiento celular disminuye. La producción aeróbica de etanol en S. cereviseae se denomina Efecto Crabtree µ < µcrit µ > µcrit

8. Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana Parámetros de crecimiento y actividad β-galactosidasa Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 ºC, pH 4.7, Medio definido

9. Sistemas de cultivo Los procesos fermentativos pueden dividirse básicamente en 2 grandes grupos • Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS) Contenido de agua del medio 90-95 % • Fermentaciones en sustrato sólido (FSS) El medio son partículas húmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre

10. Reactores empleados en fermentaciones líquidas sumergidas

11. Fermentación en sustrato sólido • Hay dos formas básicas de cultivos sólidos • Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales) • Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano) Comparación a nivel de microescala entre FLS y FSS

12. Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido

13. Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida

14. Y, Fgs Co, Fo, VL C VG Y C, FS Yo, Fgo Operación de reactores Ecuaciones de balance interfase G-L Fase líquida Fase gaseosa

15. Fase exponencial Cultivo Batch • Es el cultivo mas simple • Volumen constante • Cerrado para fase líquida Fo = Fs = 0 • Composición inicial del medio determina el curso del cultivo inóculo

16. Cultivo Batch ó Balance para biomasa estacionaria desaceleración m (pendiente) =µmax exponencial Lag

17. Velocidades de crecimiento de microorganismos y células

18. Fase de desaceleración y estacionaria • Puede deberse a inhibición por producto, agotamiento de nutrientes, limitación por oxígeno • En medios complejos la fase de desaceleración es mas extendida en comparación con medios definidos. • La característica de la biomasa al final del batch puede ser controlada con la composición inicial del medio (el cultivo puede limitarse en C, N, P, etc) • En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a la falta de nutrientes (condición de starvation): supervivencia prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de stress (salino, térmico, oxidativo, osmótico), etc. Hay expresión diferencial de genes al entrar al estado estacionario • Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se mantienen viables (viables no cultivables)

19. Desventajas del cultivo batch • Dificultad de controlar el µ, excepto variando la composición del medio o las condiciones de proceso • Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del medio o toxicidad de nutrientes • Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir O2 al medio • Inconvenientes para remover calor • Tiempos muertos entre procesos disminuye la productividad. Pie de cuba

20. Cio rebalse Ci medio fresco Fo bomba reservorio BIOREACTOR Cultivo continuo El tipo básico es el quimiostato, que consiste en una suspensión celular perfectamente mezclada a la cual se adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira cultivo a igual velocidad, de este modo el VL es cte. La composición del medio que se alimenta se diseña según que sustrato es el limitante Fo, Ci

21. Cultivo continuo X transitorio estacionario s inicio alimentación

22. en e.e Cultivo continuo

23. Cultivo continuo Balance de biomasa Balance de sustrato Balance de producto

24. Cultivo continuo Balance de sustrato con mantenimiento (rp= 0)

25. Cultivo continuo µmax = 1.0 h-1 Y´x/s= 0,5 gX /gS ms = 0,05 gS/gX h Ks = 5 mg/l S0 = 2,0 g/l

26. Aplicaciones del cultivo continuo • Estudios fisiológicos. Se puede discriminar el efecto de la velocidad de crecimiento y de las condiciones de cultivo en la fisiología celular. • Varío la composición del medio y parámetros del cultivo a µ =cte • Varío µ manteniendo cte el resto de los parámetros • Muestreo estadístico en el estado estacionario Inconvenientes del sistema continuo • Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de plásmidos • Contaminación • Imposibilidad de establecer estado estacionario

27. Vf Vo C(t) F(t) V(t) C(t) bomba reservorio BIOREACTOR Vr = Vf - Vo Cultivo batch alimentado (B.A) • Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen varía con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A • Controlado por alimentación: el cultivo sigue el curso que le dicta la alimentación • Con alimentación controlada: el estado del cultivo ( captado por sensores ) controla la alimentación

28. Cultivo B. A Balance de biomasa Balance de producto Balance de sustrato

29. Cultivo B. A

30. Cultivo B. A

31. Cultivo B. A El objetivo del BA es básicamente controlar el µ • Limitar la demanda de O2 del cultivo • Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto osmótico y tóxico de nutrientes • Incrementar el qp (metabolitos secundarios, proteínas recombinantes) para maximizar el Yp/s. • Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en levaduras)