Download
1 / 8
90 likes | 465 Views
Podsumowanie – wykład 3. 1. Technologia DNA Enzymy restrykcyjne – endonukleazy Trawienie restrykcyjne i ligacja DNA Topoizomeraza I Enzymatyczna metoda sekwencjonowania (Metoda Sangera ) 2. Metoda PCR Etapy reakcji Warunki reakcji ( startery, polimeraza Taq )
E N D
Podsumowanie – wykład 3 1. Technologia DNA • Enzymy restrykcyjne – endonukleazy • Trawienie restrykcyjne i ligacja DNA • Topoizomeraza I • Enzymatyczna metoda sekwencjonowania (Metoda Sangera) 2. Metoda PCR • Etapy reakcji • Warunki reakcji ( startery, polimeraza Taq) • Startery specyficzne i zdegenerowane • Typy polimeraz • Zastosowanie PCR 3. Przykłady modyfikacji PCR • RT-PCR • Multipleks PCR • Odwrotny PCR • Real Time PCR • RACE PCR
Nukleazy restrykcyjne - endonukleazy • enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań fosfodiestrowych: tworząc końce 3’OH i 5’PO4 • rozcinają DNA tylko w miejscach, określonych przez krótkie sekwencje nukleotydów (od 4-8 par nukleotydów);sekwencje palindromowe; • rożne szczepy bakterii zawierają różne nukleazy restrykcyjne- mechanizm obronny przed obcym DNA; Nukleazyrestrykcyjne „tępe końce” „lepkie końce” Nazwy enzymów pochodzą od gatunków, z których zostały wyizolowane po raz pierwszy np. Heamophilusinfluanzaeszczep Rd (Hind III) III- trzecia endonukleaza
Topoizomeraza I • Topoizomeraza I – pochodzi z wirusa Vaccinia ; • pełni jednocześnie fukncjęendonukleazy i ligazy DNA • rozpoznaje specyficzną sekwencję pentamerową 5’-(C/T)CCTT-3’ • w naturze enzym ten uwalnia tzw. superskręty w dsDNA • systemy komercyjne z liniowymi wektorami zawierają topoimomerazę I przyłączoną do końca 3’ wektora, co ułatwia ligację i czyni ją bardziej efektywną ( 95 % w porównaniu do 60% z użyciem ligaz) Topoizomeraza I
PCR Etapy reakcji PCR • Wstępna denaturacja ( 3min w 94°C) • 25-35 cykli, każdy składa się z: • Denaturacji95°C 1 min • Hybrydyzacji50-60°C 30”-1min • Elongacji (syntezy) 72°C 1-2 min • Koniec reakcji – obniżenie temperatury do 4°C
MODYFIKACJE REAKCJI PCR • RT-PCR – matrycąjest cDNAsyntetyzowane z użyciemodwrotnejtranskryptazynabazie mRNA • Multiplex PCR – umożliwiajednoczesneamplifikowaniekilkugenów,koniecznejest dodanie do mieszaninyreakcyjnejkilku par starterów,produktyo różnejdługościłatworozdzielićpodczaselektroforezy – test do wykrycia mikroorganizmów w wodzie i pożywieniu • Odwrotny PCR (inverse PCR)- amplifikacja fragmentów oskrzydlających z obu stron odcinek DNA; • RealTime-PCR – ilościowyPCR, PCR z analiząilości produktu w czasierzeczywistym, umożliwiamonitorowanieprzebiegureakcji PCR poprzezokreslanieiloscipowstajacegoproduktu w każdymcyklu z użyciemznacznikówfluorescencyjnychnp. SYBR-Green I • RACE PCR-(RapidAmplificationcDNA-Ends)- amplifikacja 3’ i 5’ końców cDNA znanego fragmentu mRNA
Projektowanie starterów OBLICZANIE TEMPERATURY HYBRYDYZACJI 1. Zasada: 2 + 4 2°C x (A+T) + 4°C x (C+G) TACCTAGGTTGACCATCTACTAA TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 9 G+C TACCTAGGTTGACCATCTACTAA = 14 A+T • Tm = 2°C x (14) + 4°C x (9) • Tm = 28°C + 36°C = 64°C 2. Kalkulator http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer
POLIMERAZY TAQ i PFU • Syntezę DNA prowadzają polimerazy DNA najczęściej pochodzące z termostabilnychbakterii • Bakterie Thermusaquaticus odkryto w 1969 roku w gorących źródłach • Polimerazę DNA Taqwyizolowano z tych bakterii w 1976; • maksymalna aktywność w temp. 70-80°C, optimum: 72°C ; • popełnia błąd średnio co 250 nukleotydów • nieposiadaaktywności naprawczej 3’-5’ egzonukleazy • Okres półtrwania ponad 2 h (w 95° C) • Polimeraza Pfu–polimeraza pochodząca z Pyrococcusfuriosus, • posiada aktywność korekcyjną egzonukleazy i dzięki temu • wykazuje zredukowany wskaźnik błędów.
