IMUNOASAI (PEMERIKSAAN SEROLOGI)

1. IMUNOASAI (PEMERIKSAAN SEROLOGI) Departemen Patologi Klinik Univ. Wijaya Kusuma Surabaya dr. Febtarini R, Sp.PK

2. Serologi • Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu infeksi di dalam serum pasien, misalnya adanya antibodi (Ab) spesifik terhadap mikroba tertentu • Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab) • Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan Ab yang belum diketahui di dalam serum • Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk mendeteksi Ag dalam serum pasien • Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi, aglutinasi atau dengan bantuan label tertentu, misalnya label radioaktif, label enzims dll

6. 2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODI Fc -S-S- -S-S- -S-S- Regio variabel L H L H Fab Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain

7. Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai a. Spesifitas dari Ab Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari : - profil spesifitas Ab-nya & - kemurnian Ag-nya Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik/tertentu saja.

8. Antigen I Antibodi I x X x X y y Y Y Z Z z z Z v V Y x W w X w x X v Antibodi II Antigen II Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi yang mungkin terbentuk

9. b. Ukuran kuantitas Ab Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum. - Kualitatif pos. /neg.  adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan. (+/-) - Semi kuantitatif ;ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif Titer (1/10, 1/100, 1/640) - Kuantitatif ;ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku  kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol.(100 pg/mL, 2 μL/mL) Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.

10. OD X 0 5 g/dl Kadar Bahan Gambar 3. Kurva baku uji ELISA

11. FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dll 1 2 Elektrolit dan pH 3 • Waktu dan suhu.Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahap • Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuai • Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll) 4 Mekanisme Daya Tahan Nonspesifik Bahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh. Rasio Ag dan Ab 5

13. prozone postzone

14. Post zone, Tak ada presipitasi Prozone, Tak ada presipitasi Equivalent zone, Presipitasi Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya = ANTIBODI = ANTIGEN

15. BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI MACAM BAHAN :serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis Inaktivasi C56°C, 30 menit Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.

16. IMUNOASAI KADAR BAHAN RENDAH( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml) Hasil reaksi tak tampak Hasil reaksi DAPAT DILIHAT  Presipitasi/RID FAKTOR PENGUAT (LABEL)  UJI AGLUTINASI IF EIA RIA ICA Homogen Heterogen = ELISA

17. JENIS IMUNOASAI Ada 2 jenis imunoasai. I. IMUNOASAI TAK BERLABEL II. IMUNOASAI BERLABEL I. IMUNOASAI TAK BERLABEL UJI PRESIPTASI  UJI AGLUTINASI UJI FIKSASI KOMPLEMEN UJI NETRALISASI TOKSIN

18. UJI PRESIPITASI Ag yanglarut Antibodi Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam bentuk larutan menghasilkan suatu agregasi yang terlihat dengan mata PRESIPITASI Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

19. Ag. Inkubasi Serum dengan Ab Presipitasi Gambar 6. Uji presipitasi tabung

22. 2 Sera baku 1 Tes serum 8 Antisera dalam agar 3 7 Tes serum 4 6 Tes serum Tes serum 5 Tes serum GAMBAR 10. R.I.D

23. APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI Uji Tabung : VDRL - Makro Uji Slide : VDRL - Mikro Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP RID : Penentuan kelas Ig

24. Imunoelektroforesis • Migrasi protein serum di dalam gel dan apabila bertemu dengan antigen yang sesuai akan terjadi presipitasi

26. UJI AGLUTINASI Ag. pada permukaan sel Aglutinasi Ab. Tak larut Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

27. - + Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide

28. Susp. Ag Inkubasi Aglutinasi Serum ( Ab ) Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

31. AGLUTINASI TAK LANGSUNG A. AGLUTINASI PASIF B. Ab TAK LENGKAP a. Ab Monovalen b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

32. + + Partikel Ab dalam serum Ag Larut Partikel disalut Ag Partikel: Seldarah merah Lateks Carbo adsorben (Ko-aglutinasi) Aglutinasi Gambar 14. Uji aglutinasi pasif

33. APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI • Uji Slide (lempeng): uji Widal slide Uji Tabung :uji Widal tabung Aglutinasi Tak Langsung:uji Rose-Waaler III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN Hampir sama dengan uji aglut. tak langsung, Hanya Anti – Ig diganti C  Lisis Imun

34. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN • Komplemen di dalam plasma sebanyak 3 mg/ml dalam bentuk inaktif • Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab komplemen menjadi aktif (melalui jalur klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade aktivasi, misalnya lisis dari sel target

35. Prinsip Uji Komplemen

36. Komplemen Ab Ag pada permukaan sel Sensitized cell Uji Lisis Imun = Komplemen Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

37. A. Komplemen Komplemen Tak ada Lisis C C Serum dgn. Ab Terikat Uji Positif Sensitized SDM B. Komplemen Komplemen C C Lisis Serum tanpa Ab Bebas Uji Negatif Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen

38. An example of the complement fixation test. Fig. 17.14 Complement fixation test.

39. II. IMUNOASAI BERLABEL 1. CAT FLUORESENS: IF 2. RADIOISOTOP: RIA 3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA ) A. EIA HOMOGEN B. EIA HETEROGEN (ELISA) C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE 4. EMAS KOLOIDAL: ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)

40. Mikroskop Fluoresens CUCI Ab diket berlabel cat fluoresens Ag tak diket. Fiksasi pada slide Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi 1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF) Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung (direct).

41. Cuci AHG dilabel Fluorescein Ab tak diket Kompleks Ag – Ab tak tampak Ag diket. Cuci Mikroskop Fluoresens Kompleks Ag – Ab – AHG berfluoresensi Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung (indirect).

42. An example of direct and indirect immunofluorescence testing. Fig. 17.15 Immunofluorescence testing

43. KELEMAHAN UJI IF  Peralatan canggih dan mahal  Perlu tenaga terlatih  Per hari maks 25 slide / analis  Sukar dibuat otomatis  Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

44. R R R R R R R R R 2. Uji RIA Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I Radiation Counter Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop

45. R R R R R R R Cuci RADIATION COUNTER Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

46. KELEMAHAN UJI RIA  Butuh alat mahal & tenaga terlatih  Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )  Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.  Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

47. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) • Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim untuk mendeteksi adanya ikatan Antigen-Antibodi (Ag:Ab) • Enzim akan merubah (mengkonversi) substrate yang tidak berwarna (kromogen) menjadi produk berwarna yang mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab

48. Ab Anti –Ig berlabel enzim SUBSTRAT berkromogen Ag pada Fase padat PRODUK berwarna Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung

49. Direct ELISA • Untuk mendeteksi Ab Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish Peroxidase) Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (p-nitrophenyl phosphate)

50. Ab II berlabel enzim Ag SUBSTRAT berkromogen Ab I pada Fase padat PRODUK berwarna Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung) double antibody sandwich ELISA