Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática

1. Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq.eel.usp.br

2. Cinética das reações catalisadas por enzimas 1. Efeito da concentração de substrato • Conteúdo: • Cinética de uma reação simples • Determinando Vmax e Km • Significado de Km • Cinética do tipo cooperativo

3. A atividade de uma enzima e a concentração do substrato não são, em geral, proporcionais Qual a porcentagem dos sítios ativos estão ocupados?

4. Por que estudar a cinética enzimática? • Determinar as constantes cinéticas do S e dos inibidores • Ajudar a elucidar os mecanismos de reação • Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica • Conhecer as condições ótimas de catálise

5. A velocidade da reação é proporcional a S

6. Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas. O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos: V = k3 [ES] K1 [E] [S] = K2 [ES] K2 = [E] [S] K1 [ES]

7. 1) V = k3 [ES] K2 = Ks = [E] [S] K1 [ES] [ES] = [E] [S] ks 2) [Et] = [E] + [ES] V = k3 [ES] [Et] [E] + [ES] [E] [S] ks V = K3 Et E + [E] [S] ks V= Vm [S] ks + [S]

8. Hipótese de Briggs - Haldane ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES) ETAPA 2.Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E)

9. A reação do anterior está representada no equilíbrio: • onde k1, k2, k3e k4 são as constantes de velocidade de cada etapa. • Nesse caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de formação do produto será:

10. Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação: A velocidade inicial de reação neste caso é dada por: Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da reação.

11. Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES ou...k1[E].[S] = (k2+ k3)[ES] (eq. 3) A equação 3 pode ser re-arranjada em: Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, conhecida como Constante de Michaelis:

12. No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade da FORMAÇÃO de ES. Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo substrato. Km ALTO = Baixa afinidade e Km BAIXO = Alta afinidade

13. Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com substrato), Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é Vo = k3.[ES]:

14. Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= [ES], então a equação 10, pode ser representada por: •Se [S]<<<Km, então: Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km •E se [S] >>>> Km, Vo = Vmax V0= k3[E]TOTAL •Se V0=Vmáx/2, temos: Km = [S]. Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!

15. Significado de Km • Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica • Fornece uma medida da [S] para que ocorra uma catálise significativa • Km esta relacionado as constantes de velocidade de cada etapa da reacão

16. Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica • É uma medida de eficiência da Enzima • Permite comparar a preferência de uma Enzima para diferentes Substratos

17. Significado do kcat/KM: A perfeição cinética

18. Determinação experimental dos parâmetros cinéticos Diagrama Lineweaver-Burk (Duplo-Recíproco) As concentrações de substrato escolhidas devem ser proximas do Km

19. Críticas ao gráfico L.B. • Aumentos iguais de S que fornecem pontos igualmente espaçados no grafico V x S não fornecem pontos igualmente espaçados no L.B. • Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e aparecem poucos pontos mais altos da escala e são os que devem pesar no traçado da reta • Pequenos erros na determinação de V se tornam maiores quando se calcula o seu recíproco.

20. Vmax Inclinação = v -Km Vmax v Km [S] • Gráfico de Eadie-Hofstee Não envolve o recíproco de V e podem tornar mais precisos

21. Inclinação = [S] Km 1 v Vmax Vmax -Km [S] • Gráfico de Hanes-Woolf Mais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S

22. Exercício: • Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a reação S-P. As concentrações de substrato abrangem uma faixa bastante ampla para nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos lineares. Trace os gráficos e determine Km e Vmax.

23. INFLUÊNCIA DACONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação com o aumento da concentração de substrato: Ou seja,Vmáx e Km podem ser calculados quando V0 é medida em função de várias concentrações de substrato. • Quando [S] é muito grande – V = Vmax • P = Vmax . t

24. Ordem da reação 2) Quando S é muito pequeno Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km K é uma constante de primeira ordem (min -1) -dS = kS dt

25. Exercício: • Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial de [S] de 2 x 10-5 M. Em 6 min, metade do substrato foi utilizado. O Km para o substrato é de 5 x 10 -3 M . Calcule a) k, b) Vmax, c) concentração de produto formado em 15 min.

26. Enzimas Alostéricas • Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten • Quanto maior a [S] maior será a atividade da E até esta alcançar o Vmax • A curva da V versus [S] e sigmóide • Segue modelo da curva de saturação da Hemoglobina com O2 • Sistema cooperativo

27. Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o. Inibidor alostérico Ativador alostérico Gráfico V x S é uma curva sigmóide

28. Enzimas com sítios múltiplos 1) Sitios independentes (hiperbólica) 2) Sítios interdependentes (Sigmoidal) Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax - hiperbólica Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km - Cinética sigmoidal (indica cooperatividade)

29. k’ k3 E + hS ------ ESh ------- ESh-1 + P V = k3 [ESh] (1) Et = [E] + [ESh] [ESh] = [E] [S]h / k’ V = k3 [ESh] Et [E] + [ESh] V = k3 [E] [S]h / k’ Et [E] + [E] [S]h / k’ V = k3 [S]h [Et] k’ + [S]h V = Vm [S]h K’ + [S]h

30. Equações de V x [S] [S] é a concentração de substrato S50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e em que a velocidade é metade de Vmax. h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a equação acima simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).

31. A equação de Hill também é linearizável: V = Vm [S]h K’ + [S]h Rearranjando: vK’ + v[S]h = Vm [S]h Vk’ = Vm[S]h –v[S]h Vk’ = (Vm – v) [S]h V = [S]h Vm – V k’ Log ( V ) = h log [S] - log k’ (Equação de Hill) ( Vm – V )

32. Exercício: Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou estime as constantes cinética apropriadas (Km, Vmax ou K’ [S]0,5 , nap e Vmax) [S] (M x 104) V (micromoles/L/min) 6,5 1,54 12,5 5,88 25 20 50 50 100 80 200 94,12 400 98,46 800 99,61

33. Considerações finais: 1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o modo como a atividade da enzima se modifica quando se alteram as condições do meio em que esta é ensaiada. 2) O estudo cinético de uma enzima é importante para caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a funcionalmente das demais enzimas inclusive das que podem catalisar a mesma reação. 3) O desenho de condições de ensaio adequadas à dosagem de uma enzima numa preparação biológica complexa é feita com base em estudos de cinética.