microRNAs Silvia Juliana Serrano Gómez BSc , MSc Coordinadora FICMAC- Lab

1. microRNAsSilvia Juliana Serrano Gómez BSc, MScCoordinadora FICMAC-Lab

2. Dogma central de la biología molecular • Tipos de ARN • mARN: Mensajero • Ribosomal RNA (rARN) • tranferenciaRNA (tARN) Transcripción y traducción ARN: AcidoRibonucleico

3. ADN Vs. ARN ACIDOS NUCLEICOS: Grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada.

4. Transcipciongenica ADN molde Región de transcripción - Promotor Factores de transcripción ARN Polimerasa

6. Generación de mARN

7. Splicing del mRNA Generación de mARN

8. Traducción del ARN

9. Quees un microRNA? • Familia de pequeños ARNs (Small RNAs) Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresión génica. Pasos para la generación de un microRNA 1. Gen codificante de microRNA Transcrito de 70nt 2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop) 3. Pre-miRNAesprocedasoporDICER en un miRNA de 21 – 25nt

10. miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target  degradación del mRNA: RNAi INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL 2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION) microRNAsComo regulan la expresióngénica?

11. Como regular la expresión génicaBiogénesis de los microRNAs Precursor largo RNAse III 70 nt RNAi Regulación génica RNAse III

12. Unión parcial por el 3’UTR del mRNA

13. microRNAsCaracterísticas

14. Alteraciones a nivel de transcripción Durante el procesamiento del miRNA Annu Rev Pathol. 2009 ; 4: 199–227

15. Supresores tumorales y oncogenes NO-Bloquea transcripción de oncogén Bloquear transcripción de supresor tumoral

16. Generalidades microRNAs en cáncer • Secuencias corta de RNA (~22-5pb) • Actúan a través que un complejo supresor (RISC) • Degradación del mRNA blanco • Represión de la traducción • Un daño en le procesamiento del miRNA se puede traducir en predisposición a cáncer

17. microRNAs en gliomas

18. miRNAs y expresion en gliomasmiR-21 Determinación de niveles de miR-21 qRT-PCR Northern blot miR-21: Involucrado en estos procesos claves • Proliferación microvascular: Reorganización de la matriz extracelular y capacidad de proliferación

19. Rutas moleculares afectadas por miR-21 Ensayos usando anti-miR-21 miR-21:oncogen Promueve: proliferacion, anti-apoptosis e invasión

20. Blancos miR21ApoptosisProliferaciónInvasiónMigración 3 2 4 1

21. Ruta de p53 Ruta de TGFβ En Apoptosis Citoquina inhibidora del crecimiento Estabilizar p53 Efecto ANTI-APOPTOTICO

22. Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP: Peptidasas – degradación matriz extracelular Niveles aumentados en gliomas

23. Ruta mediada por PDC4 Efectos sobre la proliferación

24. mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)

25. Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidor

26. Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxol Inhibición en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentración taxol-inhibidor

27. Actividad de AKT: Contribuye a supervivenciaEnsayos Western-Blot Taxol Taxol Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21 Anti-miR-21 Reducción de la expresión de p-AKT usando combinación del inhibidor y quimioterapia

28. miRNAs y apoptosis 24,68% 21,97% 18,74% 21,75% 6,24% 6,24% Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo

29. miR-21 y resistencia temozolamida

30. Ensayos de viabilidad celular Tratamiento con miR-21 hace células resistentes a tratamiento con TMZ

31. Ensayo de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis

32. Cascadas de señalización Bax/Bcl2Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias Expresión relativa del radio Bax/Bcl2 Medición niveles Bax y Bcl2 por western blot

33. miR-7 y proliferación Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulación de miR-7 en glioblastoma

34. Vía del EGFR-AKT PROLIFERACION CELULAR

35. EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomas

36. Inmunoblot de EGFR Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT Inmunoblot de AKT: fosforilación en Ser173

37. IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7

38. EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibición de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibición de EGFR? miR-7 suprime la activación de AKT independientemente de la inhibición del EGFR

39. Conclusiones (1) • Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que regulan a expresión de diferentes genes • Dos mecanismos de regulación: • iRNA • microRNA • La gran mayoría de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frágiles asociados con cáncer • Daños en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de cáncer.

40. Conclusiones (2) • mirR21 es un oncogén sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioterapéuticos  Apoptosis • microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresión de EGFR y AKT  Proliferación celular • Representan un blanco terapéutico  Uso de antagonistas