PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAs) A PARTIR DE Ralstonia eutropha EN UN MEDIO CON HARINA DE YUCA COMO FUENTE DE

1. “AÑO DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD” “ “PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHAs) A PARTIR DE Ralstonia eutropha EN UN MEDIO CON HARINA DE YUCA COMO FUENTE DE CARBONO “ ELIZABETH ROJAS FERNÁNDEZ1, JOSÉ LUIS HOYOS CONCHA2, SILVIO ANDRÉS MOSQUERA SÁNCHEZ3 Junio de 2016. CURSO: Biotecnología DOCENTE: Dr. Hebert Soto Gonzales ESTUDIANTE: Karesly Rojas Talavera CICLO: VII Ilo, 16 de Agosto de 2020.

2. INTRODUCCIÓN OBJETIVO Una de las bacterias más usadas en la producción de PHA, es la ralstoria eutropha, debido a que es capaz de almacenar hasta un 96% de este material en peso seco. (Betancur, M. y Agudelo, 2011) Los costos varían de acuerdo a la fermentación bacteriana aplicada. Obtener PHAs a partir de Ralstonia eutropha en un sustrato con harina de yuca HMC1 y caracterizarlo térmica y microscópicamente. Los PHAs son considerados un candidato ideal en el reemplazo de los plásticos derivados del petróleo no biodegradables. Los polihidroxialcanoatos son biopolímeros sintetizados por numerosas bacterias y son biodegradables. PHA: 2,13 - 15 dólares x kg Derivados del petróleo: 1 - 1,45 dólares x kg (Gómez, 2013) Propuesta PHAs Bacteria Desventajas DESARROLLO OBTENCIÓN DE GLUCOSA A PARTIR DE HARINA DE YUCA POR HIDROLISIS ENZIMÁTICA. ACTIVACIÓN Y CRIOCONSERVACIÓN DE Ralstonia eutropha. FERMENTACIÓN BACTERIANA CON Ralstonia eutropha. TÉCNICA DE NÚMERO MÁS PROBABLE PRUEBA DE TURBIDEZ Material o Bacteria Ralstonia eutropha o Triptona 17 g/L o Soytona 3g/L o Glucosa 2,5 g/L o NaCl 5 g/L o Fosfato dipotásico de H 2,5 g/L o Glicerol al 15% o Crioconservadora Material o Enzima BAN 480L (alfa-amilasa) o Enzima Dextrozime GA glucoamilasa (glucano 1,4 alfa-glucosidasa) o Harina de Yuca o CaCl o Columna con Carbón Activado Material o Sales minerales (MSM) o Bacteria cultivada en el medio tripticasa al 10% o Solución isotónica al 0.9% o Fuente de C (jarabe de glucosa) o Fuente de N (Sulfato de amonio) Material oEspectrofotómetro Material oPlaca de Petri oBombilla de succión Métodos o La bacteria R.e. fue activada en medio Tripticasa Soya, aplicando la metodología de Betancur (Betancur, M. y Agudelo, 2011). o Incubación: 32°C - 48 h. Crioconservación en glicerol al 15% a T<0°C Métodos o Se realizó una hidrolisis enzimática por 90' a 65°C para liberar el almidón retenido en la matriz fibrosa y obtener glucosa. o Se mezcló harina en H2O al 20% b.s. con un pH de 5,7, se usó el CaCl como coafactor. o Una vez inactiva la primera enzima, se ajusta el Ph una vez más a 4,3 para la segunda etapa a 62°C con agitación cte. Por 18h. o Se determinó con el método DNS la cantidad de glucosa. Métodos o La fermentación duró 36 h. en un medio mineral a 30°C a 150 rpm, se usó como inóculo la bacteria cultivada. o Se centrifugó y se lavó con una solución isotónica por 30' a 4500 rpm o Se aplicó en método NMP y la técnica de DNS para obtener variables de respuesta. Método o Se dividió la placa en 5 zonas iguales, se sembraron en cada una 5 microgotas de 3uL, incubándolas a 30°C por 2 días. o La población estimada se determinó con base a la tabla de número más probable para series de diluciones en réplicas • de cinco por nivel de dilución, aplicando la ecuación correspondiente. Métodos oSe midió la turbidez de cada muestra a 500 nm cada 3hrs. Resultados o Formación de colonias en TBS. Por medio de tinción de Gram, se identificó la morfología de bacilo Gram negativo, a nivel macroscópico las colonias eran uniformes, de buen tamaño, color beige, bordes redondeados y traslucidas. Resultados o Debido a la generación de dextrosas y algunos carbohidratos por la hidrolisis, el color cambio de blanco a café claro. o Se alcanzó un 10% y 12% equivalente de dextrosa con (alfa-amilasa)alcanzando un mayor grado de hidrolisis (79% de dextrosa) en la hora 18. Resultados o Se evaluó la relación C/N. Se usó el programa SPSS 20,0 (promedios de Tukey) para 5 tratamiento. o Se obtuvieron 3 subconjuntos homogéneos (alfa = 0,05) o La relación más promisoria fue 20 con una producción de 0,62c (g/L) de biopolímero Resultados o Se inició con una concentración celular de 7,67*106 cel/mL y luego de 20 h. en la fase estacionaria se generó 9,00*109 cel/mL de células y luego esta cantidad descendió. Resultados oLa bacteria de adaptó al medio MSM durante las primeras 8 hrs de fermentación, al tiempo comienza la acumulación de biopolímero debido a limitación de N y exceso de C.

3. DETERMINACIÓN DE CONSUMO DE SUSTRATO MEDIANTE DNS EXTRACCIÓN DEL BIOPOLÍMERO OBTENIDO CARACTERIZACIÓN TÉRMICA CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Material o1mL de muestra fermentada a intervalos de 3hrs. o1mL de reactivo DNS o3mL de H2O destilada oVortex oHielo oEspectrofotómetro SHIMADU UV-1800 Material oEquipo de Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC) o5mg de PHA oCápsula de Al oEquipo TGA TA Instruments, Q50, USA. Material oBromuro de potasio (KBr) oPHA altamente macerado oThermo Fisher Scientific, Niccolet 200. USA oPellets activos: Capas de bronce y capa de oro (40-50nm) oAcelerador de voltaje 5kV Material oCentrifugadora o5mL de H2SO4 a 0,1 M oNaOH a 5N oSecadora oHipoclorito de Sodio al 3% Método oSe empleó 1mL de la muestra fermentada a una concentración de 800ppm, se agregó el reactivo DNS y agua destilada. Se agitó en un vortex por 30'' llevados a ebullición por 5' y se detuvo la reacción en baño de hielo por 10'. oSe dio lecturas a las muestras por espectrofotometría a una longitud de 500nm. Método o5mg de la muestra fueron colocados en un capsula de aluminio y se sometió a un barrido térmico (-50°C y 250°C a 20°C/min) para identificar el tipo de polímero. oEste análisis se llevó a cabo bajo una atmosfera controlada con el equipo Q50 a una tasa de calentamiento de 20°C/min desde 25°C a 400°C. Método oSe realizó una prueba IR-FT a las pastillas previamente preparadas, las cuales estaban compuestas por KBr (secado al 100% y PHA. oSe realizó microscopia electrónica de barrido a los pallets activos. oSe examinaron las muestras usando un acelerador de voltaje a 60% de humedad relativa y 23°C. Método oSe centrifugó el medio fermentado a 4500 rpm por 15'. oSe extrajo el PHA aplicando H2SO4 , se llevó a ebullición por 1h. oSe centrifugó por 2da vez y se ajustó el pH a 10 con NaOH. oSe secaron las muetsras por 10 hrs a 30°C. oSe decoloró el PHA con NaClO al 3%. Resultados oA las 20 h. la bacteria inicia la fase estacionaria y se da un equilibrio entre las bacteria generadas y células no viables, consumen la fuente de C rápidamente con el fin de generar reservas en su organismo (PHA) oDespués de 36 h. se decide detener el proceso ya que no se desea que la R. eutropha use sus reservas ya que estas son el material polimérico que se desea obtener. Resultados oSe hace comparaciones de temperaturas de fusión y descomposición reportados en otras literaturas, observándose que el material es PHB (polihidroxibutirato) Resultados • El análisis de las muestras obtenidas por FTIR permitió confirmar el material obtenido es PHB, debido a las coincidencias que se encontraron en las bandas características del biopolímero con los hallazgos de otros investigadores, además, coincidió con el análisis de la caracterización térmica. CONCLUSIONES: • Se obtuvo un equivalente del 79% de dextrosa a partir de la harina de yuca corroborando el alto rendimiento de este proceso, además, no se generaron productos secundarios. • La producción de PHA se dio en mayor proporción (0,62 g/L) aplicando la relación de C/N 20. • Por DSC y FTIR se logró identificar que el biopolímero era de tipo PHB.