HbA1c : welke methode, welke calibratie Werkgroep Biologen Antwerpen 5/12/2005

1. HbA1c : welke methode, welke calibratieWerkgroep Biologen Antwerpen5/12/2005 Apr. Klin. Biol. Koen Desmet Laboratoriumgeneeskunde UZ GHB - Leuven

2. DCCT • Nine-year study concluded: Improved glycemic control is an effective preventive strategy for reducing the risk of retinopathy, nephropathy, and neuropathy • In IDDM (insulin-dependent diabetes mellitus) patients, intensive insulin treatment: • Delays the onset and slows the progression of microvascular complications • Produces significant financial savings when part of long-term monitoring and control

3. HbA1c • HbA1c results monitor glucose control over the preceding 90 to 120 days • Complete normalization of glycemia levels may prevent complications • Quarterly HbA1c determination recommended for all insulin-treated patients

4. HbA1c - terugblik in de tijd? • 50 % van het HbA1c resultaat is afkomstig van glucosespiegels van 30 dagen terug • slechts 10 % is afkomstig van glucosespiegels die 90 à 120 dagen teruggaan. • 25 % van het HbA1c werd gevormd in de voorbije 12 dagen • 90 % gedurende de laatste 62 dagen. Rohlfing et al. Diabetes Care 25:275-278, 2002 Zielke R., Henrichs H.R., Klin. Lab. 39:988-990, 1993

5. HbA1c diagnostisch? • EPIC –Norfolk study • Cardiovaculair risico neemt toe zelfs binnen het normale bereik • Laagste risico bij HbA1c < 5% • 1% stijging is geassocieerd met 1,24 (mannen) en 1,28 (vrouwen) relatief risico in mortaliteit • Verband met coloncarcinoom?

6. Reactie van Maillard (1912) Definitie van de Maillard condensatiereactie: nucleofiele additie van een vrije amine-functie van bv. een aminozuur, peptide of proteïne op een carbonylgroep van een reducerende suiker Door verdere omzetting ontstaan vluchtige stoffen en gepolymeriseerde complexen = Niet enzymatische bruinverkleuring

7. K+1 H K2 Hb -NH2 Hb -+HN=CH -N-CH2 O=CH Hb _ _ _ K-1 HC-OH HC-OH C=O _ _ _ HO-CH HO-CH HO-CH _ _ _ HC-OH HC-OH HC-OH _ _ _ HC-OH HC-OH HC-OH _ _ _ CH2OH CH2OH CH2OH Amadori-omlegging + Hemoglobine Glucose Aldimine (Schiffse base) Ketoamine niet enzymatische glycatie

8. Glyceringsplaatsen op Hb b-Val-1 a- Lys-16 b- Lys-66 b- Lys-17 a- Val-1 a- Lys-7 a = 141 aminozuren b- Lys-120 b = 146 aminozuren b a a b H. Reinauer: Klin.Lab. 1993; 984-87

9. Approximatieve graad van glycering • 60 % thv b-N-Valine • 6 % thv a-N-Valine • 18 % thv b-e-Lysine-residu • 16 % thv a-e-Lysine-residu

10. Glycohemoglobine • Meer dan 20 methodes commerciëel beschikbaar • Methoden gebaseerd op • fysische • chemische eigenschappen • antilichaam-herkenning • Interferentie door structurele varianten en chemische afgeleiden zijn bekend

11. Glycohemoglobinemethodes

12. Methoden in EKE

13. Kationuitwisselingschromatografie • BioRex 70 temperatuursafhankelijk interferentie door lipiden labiele fractie (Schiffse base) interferentie • Ge-automatiseerde HPLC systemen Menarini, Tosoh, Hitachi, BioRad, Home made (bv. Mono-S kolom)

14. Kationuitwisselingschromatografie • Omzeilen van labiele fractie interferentie: incubatie in fys. zoutopl. (bv. 4 h bij 37 °C) chemische hulpmiddelen (ev. in situ) • Vermijden van ontaarding van het Hb koeling van de staalcompartiment on line hemolyseren • Minimaliseren van kolomvervuiling spoelprocedures

15. Chromatogram Bio Rex 70 HbA0 ? HbA1c

16. BioRad Variant II

17. H/LPLC specificiteit α α-glyc α β β β-glyc α α β-glyc α-glyc β-glyc Peterson K.P., Clin. Chem. 1998; 44:9 , 1951-58

18. CH2-NH-Hb CH2-NH-Hb _ _ C=O C=O _ _ HO-CH HO-CH HO _ _ -NH- + B- HC HC-OH HO _ _ HC HC-OH OH _ _ HO-CH2 HO-CH2 O -NH- B- O OH Affiniteitschromatografie

19. Affiniteitschromatografie • Geen significante invloed van: temperatuur uremie foetaal hemoglobine labiele Schiffse base • Specificiteit van de binding ? (glycoHb)

20. Immuno-assay schematisch 5 µL bloed 250 µL hemolyse reagens manueel 5 min. wachttijd toestel HbA1c bepaling Hb bepaling immunologisch colorimetrisch ratio HbA1c/Hb HbA1c %HPLC = a · ratio HbA1c/Hb + b

21. Peptidevorming Pepsine Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser

22. Immunoassay - Roche glycopeptiden antibody latex bound glycopeptiden antibody latex agglutinator agglutinated latex

24. Interferenties

25. Hb afgeleiden Gekende chemische veranderingen van het Hb • gecarbamyleerd Hb bij uremische patiënten • geacetyleerd Hb bij chronisch gebruik van hoge dosis acetylsalicylzuur • verbinding van Hb met acetaldehyde i.g.v. alcoholisme

26. O NH2 NH2 NH4+ + -N C C = O cyanaat ureum H O NH2 NH2 Hb + -N N C Hb C = O gecarbamyleerd Hb cyanaat Gecarbamyleerd Hb Ch. M. Niederau et al. : Klin.Lab. 1993; 1015-23

27. Gecarbamyleerd Hb Vorming a rato van : 0,06 % per mmol/L ureum 0,01 % per mg/dL ureum (d.i. bij 20 – 40 mg/dL: 0,2 à 0,4 %)

28. EKE-stalen – chromatografie

29. EKE-stalen – immunoassay/eF

30. Euro 118

31. Euro 115

32. Hb varianten • >700 Hb varianten gekend • meestal puntmutaties in de a,b,g,d keten van Hb • gHb meting heeft ontdekking van nieuwe varianten meegebracht • meestal zonder fenotypische abnormaliteit • Op een totaal van ± 16 miljoen diabetici in de VS zijn >150 000 drager van een aberrant Hb • HbS en HbC meest voorkomend

33. HbAS HbSS HbEE HbAE b-Thallasemie Frankrijk - 0,2 % - - 0,6 % USA 1 - 8 % 0,3 - 1,3 % sporadisch - 1 % 13 % 2 - 5 % - - - Turkije - - 5,3 % > 40 %mogelijk - Azië Hb varianten

34. HbA1c igv abnormaal Hb

35. HbA1c igv abnormaal Hb

37. Biologische Variatie van GHb in non-diabetici Rohlfing C. et al., Clin. Chem. (2002) 48, n° 7, 1116-18

38. Biologische Variatie van GHb in non-diabetici Rohlfing C. et al., Clin. Chem. (2002) 48, n° 7, 1116-18

39. Intra-individuele CV diabetespatiënt Phillipou et al. 4,2 % (4 mnd – maandelijks) 7,1 % (15 mnd – 3-maandelijks) Petersen et al. 4,1 % (“fair control”) 5,2 % (“poor control”) Cembrowski et al. 2,4 % (3 mnd – maandelijks) 4,1 % (12 mnd – maandelijks)

40. CVa 0,5 CVi 2,1 à 3,6 % Phillipou 1,2 à 2,1 % Cembrowski Analytische CV Bij een CVa van 4 % kan een verandering in HbA1c van 0,5 % met 75 % kans als een daadwerkelijke verandering beschouwd worden Cotlove E et al. Clin.Chem. 1970;16: 1028-32

41. Analytische CV van NGSP en IFCC QC programma voor IFCC-NRL Intralab : 1,0 – 1,2 % (range 0,5 – 2,2%) Interlab : 1,4 – 1,9 % QC tijdens de 4 studies – Marrakech (’01), Chicago (’01), Kyoto I (’02) en II (’03) Intralab : IFCC 1,1 % (range 0,4 – 2,1) NGSP 1,0 % (range 0,5 – 2,4) Interlab : IFCC en NGSP 1,9 % Hoelzel W. et al.: Clin.Chem. 2004, 50:1; 166-174

42. Long term CV – iQC Low

43. Noorse studie (566 huisartsen) 3,2 % CV between office (DCA-2000) CVa 2,2 % nodig om DALING vast te stellen door 50 % van de artsen (95% CI) CVa <0 % nodig om STIJGING vast te stellen door 50 % van de artsen (95% CI)

44. Cijferverwarring • Verschillende resultaten tgv afwezigheid van een internationaal aangenomen standaard • verandering gebracht door NGSP- en IFCC groep • Moeilijk vergelijkbaar resultaten van laboratoria onderling kunnen aanleiding geven tot verwarring tussen clinici • meestal is dit probleem niet goed gekend bij de clinici • Gevolg: suboptimale diagnostische en therapeutische acties

45. DCCT studie Referentiesysteem Laboratoria : Univ. of Missouri Univ. of Minnesota

46. DCCT gevolgen Oprichting NGSP (1996) National Glycohemoglobin Standardization Program Onderschrijven door ADA (1997) van NGSP UKPDS gebruikt NGSP gecertificeerde methode

48. Certification Type # samples compared Precision Criteria Bias Criteria Monitoring(yes / no) Monitoring Protocol Manufacturer 40 4%* 95% CI of differences within ±1% GHB no - Level I Lab 40 3% 95% CI of differences within ±0.75% GHB yes 10 samples quarterly Level II Lab 40 4%* 95% CI of differences within ±1% GHB no - Summary of NGSP Certification Categories * 5% until July 2002