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Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar. Electroforesis. Definición: Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campo eléctrico. Electroforesis. v. +. -. q. Campo eléctrico E. Fuerza eléctrica Eq = fv E = campo eléctrico q = partícula cargada

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Electroforesis Capilar

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Presentation Transcript

  1. Electroforesis Capilar

  2. Electroforesis Definición: Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campoeléctrico.

  3. Electroforesis v + - q Campo eléctrico E Fuerza eléctrica Eq = fv E = campo eléctrico q = partícula cargada f = coeficiente de fricción v = velocidad Movilidad u = v/E u = movilidad Tamaño y forma de la partícula

  4. Electroforesis

  5. Electroforesis Parámetros que influyen en la movilidad electroforética • Campo eléctrico • Temperatura • Viscosidad • Fuerza iónica • pH • Carga del soluto • Forma y tamaño del los iones

  6. Electroforesis Instrumentación básica Fase estacionaria: Solutos no iónicos (sacarosa, glicerol) Soporte semisólido (papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa) “Fase móvil”: Fuente de poder que suministre voltajes de 20 V/cm - 200 V/cm

  7. Electroforesis Instrumentación básica

  8. Electroforesis Aplicaciones Método de separación de: Proteínas Ácidos nucleicos Biomoléculas (insulina, lipoproteínas, enzimas) Permite determinar: Peso molecular de proteínas Punto isoeléctico Distinguir moléculas por su carga neta

  9. Electroforesis Capilar Desventajas de la electroforesis convencional Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución Tiempos de análisis largos Análisis cuantitativo impreciso Difícil de automatizar Voltaje limitado 20 – 200 v/cm

  10. Electroforesis Capilar

  11. Antecedentes Históricos Electroforesis Capilar (1967) Hjerten usa capilares milimétricos para separar iones cargados eléctricamente, favoreciendo así la disipación del calor generado (1979) Virtamen y Makkers: desarrollan separaciones electroforéticas en capilares de 200 μm (1980) Jorgenson y Lukacs generan capilares de silica fundida con diámetros 75 μm. Surge la EC la cual opera a voltajes de 400 – 500 v/cm en cámaras refrigeradas con aire.

  12. Electroforesis Capilar Ventajas frente HPLC Tamaño de muestra: 1 – 10 nL Tiempos de análisis cortos, 10 – 40 min N = 100 000 – 200 000 Mínimo ensanchamiento de picos Consumo de reactivos reducido

  13. Electroforesis Capilar

  14. Electroforesis Capilar Definición: Nanotécnica de separación de moléculas cargadas, en el seno de una solución amortiguadora contenida dentro de un capilar.

  15. Electroforesis Capilar Fundamento: La técnica se basa en la migración diferencial de las partículas cargadas, en sentido y velocidad en un campo eléctrico

  16. Electroforesis Capilar Conceptosbásicos Velocidad de migración v= μe ·E V = velocidad lineal del ión μe = velocidad electroforética de un ión E = campo eléctrico aplicado (V/cm)

  17. Electroforesis Capilar Conceptosbásicos Velocidad electroforética μe= qE/6πηr q= carga de un ión r = radio de un ión E = campo eléctrico aplicado (V/cm) η = viscosidad de la disolución

  18. Electroforesis Capilar Conceptosbásicos Velocidad electroosmótica μeo= movilidad electroosmótica Veo Veo = μeo E 3 4 5 6 7 8 pH

  19. Electroforesis Capilar Velocidad electroosmótica V eo= μeo E Doble capa eléctrica SiO- Zona difusa

  20. Electroforesis Capilar Velocidad electroosmótico V = μeo E Dependerá de: pH, a pH altos el flujo será mayor que a pH ácidos Fuerza iónica, a mayor fuerza iónica se reduce el flujo electroosmótico

  21. Electroforesis Capilar Velocidad total del ión Vtotal= (μe + μeo )E= Ve + Veo V electroosmótica V Total = ve + veo V electroforética ++ ++ + + - - - - - - V Total = veo - ve

  22. Electroforesis Capilar Electroferograma: Grafico resultante de una electroforesis capilar Señal - - ++ + - Tiempo

  23. Electroforesis Capilar Tiempo de migración t = L2/μtotal L = Longitud de la columna μtotal = μe + μeo

  24. Electroforesis Capilar Eficiencia de la Electroforesis Capilar N = μtotal V/2D 3 D = coeficiente de difusión del soluto en cm2 s-1 V = voltaje aplicado > potencial aplicado mayor es N 2 N (x10-5) 1 0 KV 10 20 30

  25. Electroforesis Capilar Resolución R = 2(t2-t1)/W1 +W2

  26. Electroforesis Capilar Electroferograma Representación gráfica de las especias separadas por electroforesis capilar.

  27. Electroforesis Capilar Instrumentación básica Capilar de silicie

  28. Electroforesis Capilar Capilar Silice fundida recubierto de Poliimida Longitud: 20 – 100 cm Diámetro interno: 20 – 200 μm

  29. Electroforesis Capilar Soluciones llenado del capilar Buffer de Fosfatos Buffer de Boratos Solución de Cromato

  30. Electroforesis Capilar Sistema de detección Detector Limite detección UV/Vis 10-5 – 10-6 moles Fluorescencia 10-7 – 10-9 Amperométrico 10-10 – 10-11 Conductividad 10-7 – 10-8 Espectrometría de masas 10-8 – 10-9

  31. Electroforesis Capilar Tratamiento preliminar de la muestra Las muestras deben ser previamente centrifugadas y/o filtradas en filtros de 0.22 - 45 μm

  32. Electroforesis Capilar Métodos hidrodinámicos de inyección Vacío Presión Muestra Muestra Efecto sifón Muestra

  33. Electroforesis Capilar Método electrocinético de inyección Muestra 1/3 – 1/5 Voltaje de separación

  34. Electroforesis Capilar Modos de separación Electroforesis Capilar de Zona (CZE) Electroforesis Capilar de Gel (CGE) Isoelectroenfoque Capilar (CIEF) Isotacoforesis Capilar (CITP)

  35. Electroforesis Capilar Electroforesis Capilar de Zona (CZE) El capilar esta lleno con una solución buffer La separación de los iones esta influenciada por el flujo electroosmótico Uso de aditivos o modificadores de flujo electroosmótico: detergentes catiónicos

  36. Electroforesis Capilar Electroforesis Capilar de Zona (CZE) Cátodo Ánodo Buffer Buffer Buffer Buffer 3 2 1

  37. Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Separación de iones

  38. Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Antiinflamatorios

  39. Electroforesis Capilar Aplicaciones CZE Proteínas

  40. Electroforesis Capilar Electroforesis Capilar en Gel (CGE) Capilares rellenos con un gel Gel covalentemente unido a la silica (Poliacrilamida, agarosa, polietilenglicol) Gel libre en el capilar Separación esta basada en el tamaño Separación de grandes moléculas como fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas

  41. Electroforesis Capilar Electroforesis Capilar en Gel (CGE) ( + ) ( - ) + ++ ++ Gel Migración

  42. Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque (CIEF) Separación de aminoácidos anfóteros La matriz presenta un gradiente de pH Determinación de punto isoeléctrico de proteínas Orden de migración. 1º proteínas más alcalinas seguidas de las ácidas

  43. Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque (CIEF) Cátodo Ánodo H+ OH- p3 p1 p2 Gradiente de pH

  44. Electroforesis Capilar Puntos isoléctricos de proteínas

  45. Electroforesis Capilar Isoelectroenfoque de proteínas

  46. Electroforesis Capilar Skoog 5ª Ed .Principios de análisis instrumental QD79 15 S5.68 Galen W. Ewing Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25 QH 345 C.527 Rubinson and Rubinson.Química Analítica Contemporánea. Cap. 14.

  47. Electroforesis Capilar Isotacoforesis Capliar (CITP) Separación independiente de iones o cationes Utiliza un buffer discontinúo La muestra se aplica entre dos buffer

  48. Electroforesis Capilar Isotacoforesis Capilar (CITP) Buffer baja movilidad Ánodo Buffer elevada movilidad Cátodo 1 2 3

  49. Electroforesis Capilar Aplicaciones Análisis inorgánicos Ácidos orgánicos Aminoácidos, péptidos y proteínas Ácidos nucleicos y oligonucleotidos Carbohidratos y oligosacáridos Clínica Farmacología

  50. Electroforesis Capilar Principios de análisis instrumental Skoog 5ª Ed QD79 15 S5.68 Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25 Galen W. Ewing QH 345 C.527

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