ELECTROFORESIS de Agarosa

1. ELECTROFORESIS de Agarosa Dr. Jesús Lee-Borges Dra. Liza Jiménez Dr. José M. Planas Dr. Jose A. Carde-Serrano Universidad de Puerto Rico - Aguadilla

2. Objetivos • Repasar conceptos de preparación, corrida y análisis de Electroforesis • Separar los fragmentos de ADN lambda digerido usando electroforésis. • Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes enzimas de restricción.

3. ¿Qué es la electroforesis de gelatina? • Técnica usada para separar una mezcla de fragmentos o moléculas de ácido nucleico a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico.

4. Historia • 1933 - la técnica fue introducida por Tiselius • 1959 - el “gel” poliacridamida fue introducida por Raymond y Weintraub • 1975 - la electroforesis de dos dimensiones fue anunciada por P. H. O’Farrell

5. Geles comúnmente usados: • Agarosa: polisacárido extraído de algas. • No tóxico. • Poco poder de resolución pero alto grado de separación. • Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb. • Poliacrilamida: polímero de acrilamida. • Neuro-tóxico. • Menor grado de separación pero alto poder de resolución. • Para fragmentos de DNA de 500 pb. • Para separar mezclas de proteínas.

6. Marcadores de Peso Molecular • Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos. • Usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN.

7. Sistema de Amortiguadores • TBE vs TAE • TBE: DNA < 1kb • Mejor resolución • Alta capacidad de amortiguador • TAE: DNA > 12 kb • Menor capacidad amortiguador • Para DNA q se va a recobrar • Loading Buffer • Continúa. • Discontinúa.

8. Contínua vs Discontínua • Concentración de matriz • pH

9. Preparación del “gel” Agarosa

10. Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) • Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente • Gel agarosa 0.8% • _ g agarosa • _ ml 1X TAE

11. Preparación del “gel” Agarosa (Cont.) • Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida.

12. Preparación de gel: • La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.

13. Preparación de gel: • Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja. • Añadir el EtBr, 2ug/ul* • Colocar la peinilla • Dejar que se torne opaco y sólido.

14. Aparato del “gel” Consiste de: • bandeja • soporte • peine

15. Aparato de “gel” (Cont.) • Colocación del “gel” a la bandeja.

16. Aparato de “gel” (Cont.) • El tanque es llenado con amortiguador. • 1X TAE

17. Aparato de “gel” (Cont.) • Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo. • Proceder a pipetear las muestras en las fosas. • Correr gel.(50V-100V) • Teñir con EtBr

18. Práctica de uso de micropipetas: • Apoyar brazo con la micropipeta en superficie firme. • Utilizar la mano contraria para apoyar la micropipeta • Introduzcir punta dentro de fosa, sin tocar el gel • Servir el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia

19. Aparato de “gel” (Cont.) • El “gel” agarosa es cargado con muestras de ADN.

20. A B C D E F Marcador λ DNA/KPN I λ DNA uncut λ DNA/ECO RI λ DNA/BAM HI λ DNA/HIN DIII Organización del gel cargado con λADN/Enzimas de restricción Marcador λ DNA/Eco RI

21. Aparato de “gel” (Cont.) • Campo eléctrico. • 100 V • 30-45 minutos

22. Aparato de “gel” (Cont.) • Distancia migratoria.

23. Aparato de “gel” (Cont.) • El “gel”es colocado en un transluminador con luz UV.

24. Aparato de “gel” (Cont.) • Partículas de ADN. • Cortar las bandas • Guardar en microtubos • rotular

27. ¿Preguntas?

28. Preguntas • TAE vs TBE: para que es el buffer? • Que ocurre en los polos? • Porque el DNA migra hacia el lado positivo?? • Alto voltage vs bajo voltage; afecta? • Porque acrilamida en secuenciadores?

29. Asignación: • Calcular tamaños de bandas: • 1-1 • 3-1 • 6-2 • 8-2 • 9-2