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Electroforesis

Electroforesis. La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Tipos:. De frente móvil (en solución). De zona (sobre un medio soporte). En papel. Sílice. Geles (a través de una matríz porosa). Poliacrilamida.

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  1. Electroforesis La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Tipos: De frente móvil (en solución) De zona (sobre un medio soporte) En papel Sílice Geles (a través de una matríz porosa) Poliacrilamida Agarosa (DNA y proteínas) (DNA)

  2. Fel Cátodo Ánodo - + Fresist Q = carga E = potencial eléctrico V = voltaje d = distancia entre electrodos f = coeficiente de fricción v = velocidad v Tamaño y forma de la partícula Fel = Q . E = Q . V/d Fresist= f . v A v constante v partícula = Q . E Fresist = Fel Movilidad de la partícula m = v = Q f E f

  3. La movilidad del DNA depende de: Factores extrínsecos a la partícula [agarosa] o [poliacrilamida] Voltaje Buffer Tiempo Temperatura pH Factores intrínsecos a la partícula Relación carga/masa Conformación Tamaño

  4. Factores extrínsecos

  5. [ ] Agarosa % de agarosa 0,5% Log(PM o Kbs) 0,7% 1% m a b 1,2% m b > m a A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta

  6. * Fragmentos grandes de DNA se corren en geles de agarosa de campo pulsante = Agarosa Poliacrilamida Alta resolución Baja resolución (poros grandes) NO para fragmentos grandes SI fragmentos grandes Difícil de armar Fácil de armar Si el % es muy bajo el gel es frágil

  7. Voltaje aplicado V típico = 10 V / cm de gel y geles de 10 – 15 cm Mejor resolución Voltajes menores (70 V) (máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel) 100 V – 130 V OJO, V difusión

  8. Buffer de corrida Da la fuerza iónica al medio de corrida Al la [ ] de iones, la resolución Más usado. No puede reciclarse mucho. TAE TBE TPE Mayor capacidad buffer Composición

  9. Tiempo Depende del tamaño de los fragmentos a separar OJO! (Que no se caiga la muestra del gel) A tiempo resolución Temperatura A V Temperatura y la m OJO! (Se puede fundir el gel) pH Evitar modificaciones en la carga y conformación del DNA y las proteínas Hay que controlar el pH

  10. Factores intrínsecos

  11. Relación Q/m Imp. para proteínas: Q/m m Ac. Nucleicos: Q/m constante! Tamaño tamaño m

  12. Conformación del DNA DNA circulares: 3 conformaciones posibles - Circular abierto CA Lineal CCC Circular covalentemente cerrado (superenrrollado) + 0,6 a 1% agarosa Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA

  13. Loading Buffer Glicerol o ficol o sacarosa Densidad a la muestra Azul de bromofenol (corre como DNA 300 pb) Colorantes de corrida (ubicar frente de corrida) Xylene Cyanol (corre como DNA 4000 pb) Orange G (corre como DNA 50 pb)

  14. Revelado Autorradiografía DNA marcado radioactivamente (Ej. PCR radioactiva) - Se intercala cada 2,5 pb - Fluoresce naranja a la luz UV - Detecta hasta 10ng de DNA ds - En la agarosa o post-corrida BrEt (tumorigénico) Genera SC(+). Afecta movilidad CCC. Retrasa 15% lineal Agentes intercalantes Visualización durante corrida • Fluoresce amarillo • Poca afinidad gel (bajo background) • Detecta hasta 20 pg DNA ds • Seguro (no tumorigénico) • Caro SyBR Gold

  15. sintéticos cualitativos DNA fagos o plásmidos digeridos por ER Marcadores de peso molecular cuantitativos Sintéticos comerciales

  16. Cuantificación DNA Tamaño DNA fagol = 48,5 kb Muestra 48,5 kb 100% 3,53 kb 7,28% Marker Lambda EcoR1/HindIII Intensidad similar Si sembré 500 ng marker DNA: 100% 500 ng 7,28% 36,4 ng % por el vol de DNA muestra sembrado para obtener la [ ]

  17. Tipos de geles de agarosa Analíticos Comunes Preparativos Alcalino (c/NaOH) Para cDNA Para RNA Con formaldehído (desnaturaliza RNA) PGFE (en campo pulsante) Separación de fragm. > a 50 kb

  18. Recuperación del DNA del gel • Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa • Colocar trozo de gel en bolsa de diálisis • Kits de sílica gel • Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extracción con fenol. • Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA • cae en el pocillo

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