MYCOBACTERIUM ULCERANS

1. MYCOBACTERIUM ULCERANS Les méthodes de diagnostic moléculaire et d’empreintes génétiques pour Mycobacterium ulcerans

2. Introduction • PCR =polymerase chain reaction (basée sur IS2404) • but = • Détection des matières génétiques • PCR conventionnelle pour la confirmation • Nested PCR • méthodes d’empreintes génétiques • but = typages génétiques • des techniques d’empreintes génétiques ont été adaptées et développées dans le but de faire le typage génétique de la bactérie, augmentant ainsi les chances de comprendre son épidémiologie et par conséquent de permettre une meilleure prise en charge de la maladie. • Typage MIRU-VNTR (HotSTartaq PCR) • Avantage du MIRU-VNTR = différentiation entre souches non-apparentées, et souches apparentées regroupées.

3. La PCR comme méthode de détection de M. ulcerans PCR=Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification génique d’ADN • Dans le but d’amplifier correctement l’ADN d’un organisme donné, la séquence ADN de cet organisme doit être connue . En quoi consiste donc le séquençage de l’ADN? • C’est une méthode moléculaire de laboratoire qui détermine l’ordre exact des paires de base d’un segment d’ADN, ou • Une méthode pour déchiffrer/décoder l’ordre relatif des bases nucléotidiques dans une molécule d’ADN

4. Qu’est-ce que la PCR • méthode utilisée pour amplifier des séquences spécifiques d’ADN provenant d’un mélange complexe d’ADN (bactéries, virus, parasites, hommes etc…) • une amorce est nécessaire. • Qu’est-ce q’une amorce? • petite séquence d’acides nucléiques qui sert de point de départ à la réplication de l’ADN.

5. 9 F GGTGGATCTCCGCGTCATTTG R CGACCGCCCTCGAGACAG 10FACAAGCCACGGCGAGATATAG R GCGGGGCTTTTATCTGCTTA 13F CAGGTATTCCAGGAGATCAAA R GGCGACAAGGCTCGTT 14F CCTTGTATCCGAGTTTCAGTT R GTCGACCAGATATGAGCAAT 15F GCCACCGGTCAGGTCAGGTT R TCACCAACTACGACGGCGTTC 16F CCAACGCTCCCCCAACCAT RGCTCACAGGCCTTCGCTCAGA 18F CCCGGAATTGCTGATCGTGTA RGGTGCGCAGACTGGGTCTTA 19FCCGACGGATGAATCTGTAGGT R TGGCGACGATCGAGTCTC Characteristiqyes de VNTR loci du M. marinum et M. ulcerans( per courtesy of Ablordey et al. JCM 2005)

6. PRINCIPE séparation doubles brins d’ÁDN par la chaleur (dénaturation) Ensuite, une portion choisie est copiée en ADN La séquence d’ADN à amplifier est sélectionnée sur base des amorces oligonucléotidiques. Ces amorces sont complémentaires aux extrémités de la région qui doit être amplifiée Processus répété plusieurs fois augmentant exponentiellement le nombre d’ADN copié. PRINCIPE Au terme de chaque cycle de synthèse les complexes ADN sont séparés par la chaleur, et ensuite refroidis afin de permettre à nouveau la fixation des amorces et le copiage. Différentes amorces sont nécessaires pour les extrémités gauches et droites de la séquence à amplifier. La séquence des bases de l’échantillon d’ADN doit donc être connue. Le Principe de laPCR

9. Qu’est-ce qu’une `Nested PCR´ I? • La spécificité de la PCR est déterminée par la spécificité des amorces PCR. • Les produits d’une réaction initiale d’amplification sont dilués et utilisés comme source d’ADN cible pour une seconde réaction dans laquelle un set d’amorces différentes est utilisé. En effet ces amorces correspondent à des séquences proches et externes à celles utilisées pour la première réaction . • Les produits de la réaction d’amplification sont dilués et utilisés comme source d’ADN cible pour une seconde réaction dans laquelle un set d’amorces différentes est utilisé. En effet, ces amorces correspondent à des séquence proches et internes à celles utilisées pour la première réaction. Le produit est plus court que le premier, réduisant ainsi la probabilité d’amplifier un `mauvais´ locus une seconde fois si cela a été le cas la première fois.

10. Diagramme illustratif de la Nested PCR(avec la gracieuse permission de Richard Wheeler)

11. Que signifie le Départ à chaud d’une PCR ? = Hotstartaq PCR(Qiagen technologies) • Les techniques de Hot Start PCR focalisent sur l’inhibition de l’activité de la polymérase durant la préparation de la réaction. • En limitant l’activité de la polymérase avant le cycle PCR,(donc en augmentant le temps de dénaturation), l’amplification non-spécifique est réduite et le rendement cible est augmenté.

12. Quelques avantages de la PCR dans le diagnostic de L’Ulcère de Buruli? • La sensibilité • La capacité a détecter dés infections latentes • Seul un fragment d’ADN suffit pour l’amplification • La spécificité et la stabilité (amorces, Nested PCR) • Plus rapides que la culture: résultats en qq hrs par apport aux cultures, mais remplace jamais la culture • Un grand nombre d’échantillons peuvent être étudiés en même temps • La comparaison entre espèces et au sein des espèces (comme c’est le cas de M. marinum and M. ulcerans)

13. Quelques inconvénients de l’utilisation de la PCR comme outil diagnostic • Nécessité d’avoir des information sur la séquence d’ADN cible • Le manque de fidélité de la réplication, et donc la nécessité d’utiliser la Nested PCR • Nécessite a disposer de plusieurs locaux et d’utilise du matériel à usage unique pour éviter du contaminations (faux positifs) • Faux négatifs

14. Que faut-il pour faire une PCR • Echantillon:de l’ADN bactérien • Appareil:Un thermocycleur, configuré pour un protocole spécifique • Réactifs: - Un mélange PCR (PCR Mix) • Des amorces (forward & reverse primers) • Nucléotides; dNTPs (dATP, dCTP, dGTP and dTTP ) • Une ADN polymérase thermostable (Taq polymerase) Thermus aquqticus • Tampon • MgCl2+ • De l’eau distillée ----------------------------------------------------------------------- • Solution Q (pour Hotstartaq PCR, produit par Qiagen technologies) (voir protocoles de travaux pratiques)

15. EMPREINTES GENETIQUES • QU’EST-CE QU’UNE MÉTHODE D’EMPREINTE GÉNÉTIQUE? • C’est une méthode moléculaire utilisée pour détecter des différences et/ou des similarités génétiques entre espèces ou au sein d’espèces isolées de sources variées. • Les sources peuvent être: • Cliniques • Ecouvillons provenant d’ulcères • Biopsies • Autres • Environnementales • Autres

16. Quelques exemples de méthodes d’empreintes génétiques • Mycobacterial Interspersed Repetitive Units -Variable Numbers of Tandem Repeats (MIRU-VNTR) • Analyse d’endonucléase de restriction (REA) • Polymorphisme de longueur des fragments de restriction, après hybridation (RFLP) • Spoligotyping • Séquençages

17. TECHNIQUES actuellement utilisées pour l’identification et l’empreinte génétique de Mycobacterium ulcerans • PCR ou Polymerase Chain Reaction. • Hotstartaq PCR : pour le typage par la méthode de MIRU-VNTR. Souvent utilisé pour les échantillons cliniques ou les souches du laboratoire (by Qiagen & Agilent technologies) • Nested PCR’s : pour les biopsies et les échantillons environnementaux • TYPAGE MIRU-VNTR

18. Principe du MIRU-VNTR • MIRU ou “Mycobacterial Interspersed Repetitive Units” sont des tandems de séquences répétées trouvées dans des nombres variables de régions intergéniques ou “Variable Numbers of tandem Repeats“  (VNTR). • Dans le but d’étudier les MIRU-VNTR de M. ulcerans, une PCR doit être effectuée pour l’amplification de l’ADN à investiguer. • Les produits du PCR (appelés les amplicons) sont mis en évidence manuellement (électrophorèse sur gel), ou par un système automatisé ( Bioanalyzer etc). • L'évaluation de la longueur de leurs paires de bases fournit une indication du nombre de répétitions dans chaque locus. 12 loci identifiés comme les plus polymorphes donnent 12 numéros de code qui peuvent être utilisés pour comparer les souches de M. tuberculosis. Mais, chez M. ulcerans seulement 5 loci ont démontré des caractéristiques polymorphiques.

19. Quelques définitions • Qu’est-ce q’un locus génétique • C’est la position d’un gène sur une carte de liaison génétique ou sur un chromosome. C’est également la place spécifique, sur le chromosome, où ce gène est situé.

20. Position du loci 41 MIRU sur le chromosome H37Rv de M. tuberculosis(avec la gracieuse permission de Supply et al. 2000)

21. Quelques définitions II • Un marqueur ADNest toute séquence unique d’ADN qui peut être utilisée dans l’hybridation, comme dans la PCR • Hybridation • Quand l’ADN est chauffé aux températures de dénaturation pour former des ADN simples brins et ensuite refroidi, des doubles hélices vont se reformer (renaturation) au niveau des régions possédant des séquences complémentaires. Cette technique est utile pour la détermination de séquences similaires dans des ADN d’origines différentes mais aussi pour la quantité de séquences répétitives au sein d’un même ADN (typage MIRU-VNTR!).

22. Polymorphism in amplicons of locus 40 for 20 isolates of M. tuberculosis Beijing strainGladys Anyo. LSHTM UK,2004 • Qu’entend-on par Polymorphisme ? • Il s’agit de différences, de séquences d’ADN , entre espèces. Des variations génétiques qui apparaissent dans une population sont considérées comme des polymorphismes.

23. Mélange réactif pour Hotstartaq PCR [Loci 1, 2, 6, 9, 33]per courtesy of P.Stagier; A. Ablordey. Department of Mycobacteriology. ITM Belgium

24. Multilocus Variable-Number Tandem Repeat Typing of Mycobacteriumulcerans; Locus 19( per courtesy of Ablordey et al. JCM 2005) • FIG. 2. PCR analysis of VNTR locus 19. • (A) M. ulcerans and the intermediate strain. Lanes: L, 100-bp DNA ladder; 1, ITM 5142; 2, ITM 5147; 3, ITM 94-1324; 4, ITM 9537; 5, ITM 94-1331; 6, ITM 94-1328; 7, ITM 98-912; 8, ITM 8756; 9, ITM 842; 10, ITM 7922; 11, ITM 5114; 12, ITM 5143; 13, ITM 00-1026; 14, 50-bp ladder (locus 19); 15, ITM 96-658; 16, ITM 97-111; 17, ITM 97-483; 18, ITM 97-104; 19, ITM 5152; 20, ITM 5155; 21, ITM 97-610; 22, ITM 97-648; 23, ITM 97-680; 24, ITM 94-662; 25, ITM 94-511; 26, negative control. • (B) M. marinum. Lanes: L, 100-bp DNA ladder; 27, ITM 8022; 28, ITM 1717; 29, ITM 94-56; 30, ITM 1320; 31, ITM 7732; 32, negative control. • 5 genotypes distinguished and 2 South American strains discovered which supports the discrimination between strains even in MU

25. DNA chip gel pattern for H37Rv.Gladys Anyo LSHTM, UK 2004

26. Hotstartaq PCR et MIRU-VNTR • Voir notes pratiques

27. THANK YOU