Microbiologie de Mycobacterium ulcerans

1. Microbiologie de Mycobacterium ulcerans Cours International Centre Pasteur du Cameroun 23-30 janvier 2006 F. Portaels

2. Description de M. ulcerans • 1. Généralités • Mycobactérie à croissance lente • Primoculture positive en 6 à 8 semaines • Subculture positive en 2 semaines • Croissance optimale entre 30 et 32°C (quelques souches peuvent pousser à 37°C) • Mycobactérie non chromogène ou jaunâtre (souches africaines) • Mycobactérie sensible à la majorité des antibiotiques antimycobactériens (sauf INH, PAS, éthambutol, éthionamide, thioacétazone, thiosemicarbazone, thiocarbanilide)

3. 2a. Caractéristiques phénotypiques de M. ulcerans et d’espèces apparentées Paramètres M. ulcerans M. marinum M.shinshuense Pigmentation dans l’obscurité + - + Pigmentation à la lumière + + + Croissance à 37°C - - - Croissance sur eau peptonée - + - Croissance en présence de: Isoniazide (10 µg/ml) M M - Hydrazide de l’acide thiophène- + + - 2 carboxylique (2 µg/ml) Hydroxylamine (250 µg/ml) F + + Paranitrobenzoate (500 µg/ml) - M - NaCl à 5% - - - +:>85% de souches positives; -:<15% de souches positives; M:de 50 à 85% de souches positives; F: de 15 à 49% de souches positives

4. 2b. Caractéristiques phénotypiques de M. ulcerans et d’espèces apparentées (suite) Paramètres M. ulcerans M. marinum M.shinshuense Propriétés enzymatiques Catalase, >45 mm de mousse - - + Hydrolyse du Tween 80 (10 jours) - + - Uréase F + - Production de niacine F/- - - Réduction des nitrates - - - Phosphatase acide F + - +:>85% de souches positives; -:<15% de souches positives; M:de 50 à 85% de souches positives; F: de 15 à 49% de souches positives

5. 3a. Caractéristiques des différents sous-groupes géographiques de M. ulcerans Sous-groupes géographiques de M. ulcerans AFR AUS MEX AMS CHI JAP Pigmentation dans l’obscurité +(1) - - + - + Pigmentation à la lumière +(1) - - + - + Croissance à 37°C - - - - - - Croissance sur eau peptonée - - - - - - Croissance en présence de: Isoniazide (10 µg/ml) + M + - - - Hydrazide de thiophene-2- carboxylic (2 µg/ml) + + + + + - Hydroxylamine (250 µg/ml) - + + M + + Paranitrobenzoate (500 µg/ml) - - + - V - NaCl à 5% - - - - - - • Léger pigment jaunâtre • Résultats de Portaels et al., 1996 (JCM 1996; 34: 962-965)

6. 3b. Caractéristiques des différents sous-groupes géographiques de M. ulcerans (suite) Sous-groupes géographiques de M. ulcerans AFR AUS MEX AMS CHI JAP Propriétés enzymatiques Catalase, >45 mm de mousse - - - - - + Hydrolyse du Tween 80 (10 jours) - - - - - - Uréase - - - - - - Production de niacine - - - - - - Réduction des nitrates - - - - - - Phosphatase acide M - - - - - Résultat du séquençage (2) Type 1 Type2 Type 3 mar shin shin • Léger pigment jaunâtre • Résultats de Portaels et al., 1996 (JCM 1996; 34: 962-965)

7. 4a. Sensibilité in vitro de M. ulcerans aux antimycobactériens Antimycobactérien Milieu µg/ml (1) Croissance Isoniazide L-J 0,1 10 + Acide para-aminosalicyclique L-J 0,5 50 + Ethambutol L-J 0,25 5 + Streptomycine L-J 2 50 - Rifampicine 7H11 2 - L-J 4 40 - Ethionamide L-J 4 30 + Cyclosérine L-J 5 30 - Kanamycine L-J 8 20 - Clarithromycine 7H11 0,5 4 - Ofloxacine 7H11 2 - Ciprofloxacine 7H11 1 - • Concentrations testées par plusieurs auteurs

8. 4b. Sensibilité in vitro de M. ulcerans aux antimycobactériens (suite) Antimycobactérien Milieu µg/ml (1) Croissance Sparfloxacine 7H11 0,5 Amikacine 7H11 2 - L-J 30 - Capréomycine L-J 16 20 - Thioacétazone L-J 2 + Thiosemicarbazone L-J 0,5 4 + Viomycin L-J 10 50 - Thiocarbanilide L-J 50 + Dapsone L-J 3 - L-J 1 F L-J 0,3 M • Concentrations testées par plusieurs auteurs

9. 5. Identification de M. ulcerans par PCR • Séquençage de l’ARN 16S. • Pas de différence entre M. ulcerans et M. marinum • PCR IS2404 • Sensibilité: excellente • Spécificité ? • D’autres espèces de mycobactéries sont aussi IS2404 positives • ex: M. liflandii, M. pseudoshottssii • Quelques souches de M. marinum • (Chemlal et al., JCM 2002; 40: 2370-2380).

10. 6a. Quelques caractéristiques phénotypiques de M. ulcerans et d’autres espèces IS2404 positives et espèces apparentées Paramètres ulc mar lif pseudoshot shott Pigmentation dans l’obscurité + - - - - Pigmentation à la lumière + - - - Croissance à 30°C + + + - F Croissance à 37°C F F - - - Croissance à 37°C - - - - - Croissance sur eau peptonée - + - Croissance sur “charcoal” - + - + Croissance en présence de: Isoniazide (10 µg/ml) M M + - Hydrazide de l’acide thiophène- + + + + + 2 carboxylique (2 µg/ml) Hydroxylamine (250 µg/ml) F F + + + + Paranitrobenzoate (500 µg/ml) - M - - NaCl à 5% - - - -

11. 6b. Quelques caractéristiques phénotypiques de M. ulcerans et d’autres espèces IS2404 positives et espèces apparentées (suite) Paramètres ulc mar lif pseudoshot shott Propriétés enzymatiques Catalase, >45 mm de mousse - - - - - Hydrolyse du Tween 80 - + - - - (10 jours) Uréase F + - + + Production de niacine F/- - +/- + + Réduction des nitrates - - - - - Phosphatase acide F + - M M IS2404 + F + + - +:>85% de souches positives; -:<15% de souches positives; M:de 50 à 85% de souches positives; F: de 15 à 49% de souches positives

12. 7. Impact des mycobactéries IS2404 positives sur le diagnostic clinique de l’UB par PCR • > 500 échantillons clinique inoculés sur “charcoal” agar (Realini et al. 1999): Aucun positif ! • 20 échantillons ZN (3+, 4+) mais culture sur LJ négative → analyse moléculaire → tous positifs pour M. ulcerans (variété africaine). • Il est peu probable que ces autres mycobactéries IS2404 positives soient responsables d’UB. Donc, pas d’impact sur le diagnostic clinique de l’UB par PCR

13. 8. Les outils moléculaires: conclusions • PCR IS2404: meilleur test pour confirmer un cas cliniquement suspect d’UB • Empreintes génétiques: - excellentes pour distinguer M. ulcerans des autres mycobactéries IS2404+ - peuvent être appliquées à des échantillons cliniques * MIRU-VNTR (Stragier et al., 2005; Ablordey et al., 2005) * IS2404/GC rich PCR (Ablordey et al., 2005)