Transzgének expressziós profiljának felvétele

1. Transzgének expressziós profiljának felvétele Kukoricabogár- és herbicid-rezisztens növények MTA MGKI

2. Mintavétel Szállítás, tárolás RNS kivonás cDNS átírás Real-time PCR Kiértékelés

3. Mintavétel és tárolás • Meghatározott szervek és fenofázisok • Nehézségek pollengyűjtésnél • RNAlater, szárazjég — -70°C

4. RNS kivonás • Összes RNS típus kivonása (rRNS referencia) • Nehézségek mag esetében • Tisztaság és gyorsaság

5. Reverz transzkripció • A kivont RNS-ről random hexamer primerek és reverz transzkriptáz segítségével DNS másolatot készítünk • rRNS-t és mRNS-t is átírjuk – referencia- és célgén • Higítások

6. Real-time PCR Alapelv a PCR-termék képződésével arányos a fluoreszcencia intenzitása, ezt a készülék folyamatosan méri exponenciális fázisban: arányos a kiindulási DNS mennyiséggel nincs PCR-t követő gélelektroforézis Alkalmazások • génexpresszió vizsgálata • genomban többször előforduló gének számlálása (kópiaszám meghat.) • genotipizálás

7. Real-time PCR Detektálás a keletkező összes PCR-terméket (nem specifikus) szekvencia specifikus: 5’ nukleáz (pl. TaqMan) SYBR Green: dsDNS interkaláló festék Összemérés – Qiagility robot R Q 5’ 3’ : riporter R : quencher Q R Q 2 1 3

8. Real-time PCR Mennyiségi mérés: a „threshold” ciklus lgRn Rn küszöb („threshold”) küszöb („threshold”) MHC08_G4 ciklusszám ciklusszám CT CT threshold: exponenciális fázisban threshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája a küszöbszintet – kiindulási DNS-mennyiséggel arányos

9. Real-time PCR Detektálás a reakció után: olvadáspont analízis eltérő szekvenciájú DNS-szakaszok olvadáspontja különbözik lassú felmelegítés Tm: két szál elválik SYBR Green jel 

10. Kiértékelés Expressziós szintek összehasonlítása