1 / 16

Metody detekce nukleotidových polymorfismů

Metody detekce nukleotidových polymorfismů. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU. Typ polymorfismu. SNP Short repeats Insertion/deletion. Metody detekce nukleotidových polymorfismů. Hledání přítomnosti neznámé alely Detekce známých alel. Využívané metodiky. PCR RFLP ELFO na agaróze

lanai
Download Presentation

Metody detekce nukleotidových polymorfismů

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody detekce nukleotidových polymorfismů MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

  2. Typ polymorfismu • SNP • Short repeats • Insertion/deletion

  3. Metody detekce nukleotidových polymorfismů • Hledání přítomnosti neznámé alely • Detekce známých alel

  4. Využívané metodiky • PCR • RFLP • ELFO na agaróze • Real time PCR • PAGE • SSCP, heteroduplexní analýza • Kapilární elektroforéza • v podstatě varianta PAGE

  5. Strategie volby metody • Flexibilita • Cena • Dostupnost • rychlost

  6. PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena

  7. Amplifikace DNA

  8. Základní komponenty reakce • voda • pufr • dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) • MgCl2 • Taq polymeráza • primers • templát

  9. Teplotní režim • 96ºC Iniciální denaturace • 96ºC denaturace • 40-72ºC annealing • 72ºC elongace • 72ºC závěrečná elongace • 4ºC zchlazení 30x

  10. Elektroforéza v agarovém gelu

  11. + -

  12. Přímá sekvenace • Viz praktikum  • Umožní detekovat dosud nepoznané mutace/polymorfismy • Drahá • Relativně zdlouhavá • Metody využívající sekvenační instrumentárium

  13. PCR s následnou RFLP • Pokud polymorfismus způsobuje vznik restrikčního místa, podrobíme produkt PCR působení daného enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme výsledek. • Mismatch primery – umožňují vnést restrikční místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci pomocí endonukleáz

  14. PCR s následnou analýzou délky produktů • Pokud je polymorfismus způsoben insercí/delecí většího počtu bází, produkt PCR analyzujeme přímo na agarové elektroforéze. V případě analýzy počtu dinukleotidových repetic používáme kapilární elektroforézu. • Alelově specifické primery – poskytnou produkt jen za přítomnosti dané aley

  15. Real-time PCR • Různé systémy sond (TaqMan, FRET) • Melting curve analysis

  16. Metody využívající kapilární sekvenátor • SNPlex • SNaPshot

More Related