Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna Pyka

1. Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowychw surowicach ANA-dodatnich w oparciu o analizę poszczególnych swoistości przeciwciałowych obecnych w KKI. Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna Pyka Zakład Mikrobiologii i Serologii Instytutu ReumatologiiWarszawa

2. Autoprzeciwciała występujące w układowych chorobach tkanki łącznej AUTOPRZECIWCIAŁA: • Czynniki reumatoidalne • Przeciwciała skierowane przeciwko antygenom jądrowym (ANA) i antygenom związanym strukturalnie lub funkcjonalnie z nimi • Przeciwciała przeciwko fosfolipidom • Przeciwciała przeciwko składnikom tkanki łącznej i innych tkanek gospodarza oraz białkom cytoszkieletu • Przeciwciała przeciwko antygenom bakterii, wirusów oraz pasożytów

3. Oznaczenie obecności oraz mian i/lub poziomów wyżej opisanych autoprzeciwciał przeciwko antygenom komórkowym wykonuje się zasadniczo z czterech następujących powodów: • obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej choroby, • miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla aktywność procesu chorobowego, • obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi, • autoprzeciwciała są inhibitorami enzymów istotnych dla funkcjonowania komórki.

4. Jednostka chorobowa Autoprzeciwciało Częstość występowania /w danym schorzeniu Swoistość /dla danego schorzenia/ SLE dodatnie ANA 95% niska anty-dsDNA 70% >90% anty-Sm 15% >95% anty-rybosomalne białko P 10% >95% anty-PCNA 3% >95% anty-histonowe 70% niska anty-U1 RNP 30% niska anty-SSA /Ro/ 30% niska anty-SSB /La/ 20% niska anty-NuHi 60% wysoka Częstość występowania oraz swoistość wybranych autoprzeciwciał “markerowych” w układowych chorobach tkanki łącznej*

5. Toczeń polekowy dodatnie ANA >90% niska anty-histonowe 80% umiarkowana MPO-ANCA 80% umiarkowana MCTD dodatnie ANA >95% niska anty-U1 RNP >90% >95% Zespół Sjögrena dodatnie ANA 80% niska anty-SSA /Ro/ 80% umiarkowana anty-SSB /La/ 70% umiarkowana IgA RF 70% umiarkowana IgM RF 70% niska anty-α-Fodryna 60% wysoka Skleroderma dodatnie ANA 90% niska anty-centromerowe 40% >90% anty-Scl-70 15% >90% anty-jąderkowe 15% >85% Zespół nakładania zapalenia wielo-/skórno-mięśniowego dodatnie ANA 40% niska dodatnia cytoplazma 20% umiarkowana anty-Jo-I 25% wysoka anty-U1 RNP 40% niska

6. Zespół antyfosfolipidowy anty-kardiolipinowe 100% umiarkowana Rzs dodatnie ANA 50% niska IgM RF 75% niska IgA RF 70% umiarkowana anty-CCP 40-60% wysoka GS-ANA 50% umiarkowana anty-histonowe 40% niska MIZS dodatnie ANA 70% umiarkowana anty-histonowe 60% umiarkowana IgM RF 15 – 30% umiarkowana GS-ANA 15% umiarkowana anty-CCP ~ 30% wysoka *Dane pochodzą z opracowania Statens Seruminstitut /Kopenhaga, Dania/ zalecanego przez European Consensus Finding Study i mogą nieznacznie różnić się od danych w tekście /pochodzących z konkretnych cytowanych prac/

7. Przeciwciała wykrywane w układowych chorobach tkanki łącznej ! Metody immunofluorescencyjneMetody immunoprecypitacyjneOdczyny immunoaglutynacyjne●Metody immunoenzymatyczne●Metody nefelometryczne

10. Przyczyny niepowodzeń 1. Typ testu (czułość testu)2. Skład antygenowy testu3. Antygeny rekombinantowe4. Natura antygenu /podfrakcje/5. Wieloswoistość surowic6. Normy7. Kompleksy immunologiczne – – – – – – – – – – – – – – – – –8. Wiek pacjenta

11. 1/80 ANA (-)‏ 1/80 ANA (+)‏ 1/160 ANA (+)‏ 1/320 i > ANA (+)‏ Porównanie częstości identyfikacji określonej swoistości ANA w grupie 76 surowic uzyskanych od pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej

12. Kaskadowa metoda oznaczania swoistości przeciwciał ANA

13. Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, jak ma miejsce w TRU, gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom poziomów i awidności autoprzeciwciał. Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia choroby zwykle towarzyszyć mogą dwa zjawiska, pierwsze to wyrzut z zajętych narządów/tkanek do krążenia autoantygenów, drugie to związanie autoprzeciwciał krążących w KKI. Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem aktywnego procesu destrukcji narządów/tkanek, a drugi prowadzi do neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich mian w surowicach.

14. Celem pracy była analiza KKI pod kątem ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich, w których klasycznymi metodami stosowanymi w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić swoistości przeciwciał ANA.

15. Materiał i metody Badania przeprowadzono na grupie 588 surowic skierowanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii IR w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia swoistości ANA. Surowice pochodziły z klinik i Polikliniki IR.

16. Materiał i metody W surowicach oznaczano następujące parametry: ·miano i typ świecenia ANA metodą IIF na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2 (firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą „Colorzyme” (firmy Immunovision, USA), ·poziomy autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland Sp. z o.o.), ·poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA), ·frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp. ·frakcję γ z osadów PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconego siarczanu amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej, ·białko we frakcji γ i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg Kalckara.

18. WynikiOdsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-)

19. WynikiOdsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-), gdzie w osadach PEG znaleziono autoprzeciwciała

20. Porównanie typów „świecenia” w met.IIF z surowic(1a,2a) i osadów PEG(1b,2b)

21. Przykłady swoistości autoprzeciwciał znalezionych w surowicach i osadach PEG metodą Western-blott

23. Struktura KKI

24. Wybrany przykład neutralizacji surowicami anty-Fc i Fab swoistości przeciwciał występujących w osadach PEGA B C A - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 B - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą antyF(ab2) C - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą anty-Fc

25. Szczegółowa analiza składu KKI na podstawie neutralizacji swoistości surowicami anty-Fc i anty-(Fab2)

27. Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się aktywności przeciwciałowej po precypitacji glikolem polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Daltonów jest efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu glikolem czy też mamy do czynienia ze zmianą konformacji poszczególnych białek wchodzących w skład KKI – będzie to przedmiotem dalszych badań w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii.

28. Autorzy w przedstawionej pracyzaproponowali nowe metodyczne podejście do analizy surowic ANA-pozytywnych, w których nie udaje się standardowymi metodami ustalić swoistości autoprzeciwciał. Zaproponowana metoda polega na analizie swoistości autoprzeciwciał nie w surowicy pełnej, ale w osadach po PEG-6000 (czy ewentualnie frakcjach γ z tego osadu), który zawiera obok innych makroglobulin surowiczych, także zgęszczoną frakcję KKI. Stosując tę metodę udało się ustalić swoistość przeciwciał występujących w KKI w 84% surowic ANA(+), w których metodą standardową nie udaje się tego dokonać. Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich podejście, po niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki przeciwciał uproszczeniach, znajdzie zastosowanie w serodiagnostyce autoprzeciwciał markerowych, i to nie tylko w układowych chorobach tkanki łącznej.

29. Dziękuję za uwagę