PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN

1. PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato

2. SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN ADNs antiguos (Mamut) ADNs escena crimen ADNs embrionarias ADN genes virales Generalmente las muestras suelen ser pequeñas se necesita AMPLIFICACIÓN mediante Es un proceso repetitivo (desnaturalización, hibridación, extensión) del que se obtienen muchas copias de un mismo fragmento de ADN TÉCNICA DE LA PCR es (polymerase chain reaction)

3. Materiales • Muestra de ADN • Cebador (P1 y P2) • Fuente de calor • Taq polimerasa (resistencia al calor) TÉCNICA DE LA PCR • Desnaturalización por calor. • Hibridación con el cebador. • Extensión de la cadena complementaria por Taq polimerasa.

4. Una vez que se tiene cantidad suficiente de ADN… SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN para fragmentos Método del didesoxi (fragmentos de unos 800 pb) no muy grandes MATERIALES Una opción es que cada didesoxinucleótido tenga una marca fluorescencia de color diferente. (otra posibilidad es hacer electroforesis en pozos separados) Cuando un didesoxinucleótido se une a la cadena en extensión se detiene la síntesis ya que no se puede unir el siguiente nucleótido al C3 sin OH

5. MÉTODO DEL DIDESOXI Una vez que se tienen todos los materiales y el ADN desnaturalizado, se inicia la síntesis de la hebra complementaria. Una vez terminada se vuelve a desnaturalizar. Se presenta lo que sucede a los fragmentos que terminan, por ejemplo, en ddA, es decir, localizan la posición de una T en el ADN a secuenciar. (en ese tubo de ensayo sólo habría ddA) Se obtienen hebras de ADN de diferente longitud, todas ellas terminadas en A. Eso indica que en esa posición había una T en el ADN a secuenciar. Las tres cadenas de ADN son iguales (obtenidas mediante PCR) (lo mismo con ddT, ddA, ddC y ddG) En algunos ADNs, la ddA se unirá a la primera T que aparece, deteniéndose ahí la síntesis. Será un fragmento pequeño.

6. MÉTODO DEL DIDESOXI Fragmentos obtenidos según ADN a secuenciar ¿Cómo se separan los diferentes fragmentos que Están en el tubo de ensayo? (Los fragmentos más pequeños se desplazan más) Por ELECTROFORESIS en GEL de acrilamida Cuatro pozillos diferentes en la electroforesis Un solo pozillo

7. MÉTODO DEL DIDESOXI En el Proyecto Genoma se utilizaron métodos basados en este sistema pero con algunas diferencias y, sobre todo, ordenadores muy potentes.