ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor V. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

2. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Ószövetség (Exodus xv. 23-5) víz tisztítás Arisztotelész (cit. Hellferich, 1959) tengervíz sótlanítás Bacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gyógyszerészet, derítés-perkolálás Thompson (1850), Way (1852) kationok adszorpciója agyagon Eichorn (1858), Boedecker (1859) egyensúlyi folyamatokra empirikus egyenletek Harms (1896) cukorgyártásban szabadalom Harms és Rümpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserélők Gans (1905) Al-szilikátok alkalmazása vízlágyításra Fischer és Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer és Winterstein (1932-35) fehérje kémiai alkalmazások, tisztítás elválasztás Adams és Holmes (1935- ) polimerkémia, szerves ioncserélők, PDB műgyanták, bakelit (hanglemez !) Moore és Stein (1945) aminosav analizis - készülék

3. IONCSERÉLŐ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA Ion Exchange Chromatography (IEX) WAX – SAX (weak – strong) WCX - SCX

4. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) • ÖSSZETEVŐKIONOS, vagy IONIZÁLHATÓ TULAJDONSÁGA • FUNKCIONÁLIS CSOPORTOK TÖLTÉSE ÉS MINŐSÉGE • IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer) • A TÖLTÉS VISZONYOK (net charge) VÁLTOZÁSA • A pH ÉS IONERŐSSÉG HATÁSÁRA • MOLEKULA TÖMEG ÉS SZERKEZET • DETEKTÁLHATÓSÁG • BIOLÓGIAI AKTIVITÁS • OLDÉKONYSÁG • STABILITÁS

5. FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

6. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ FÁZIS – IONCSERÉLŐ TÖLTETEK TENTACLES KATION CSERÉLŐK GYENGE - ERŐS ANION CSERÉLŐK ~~N+H2<~~N+HR <~~N+R2 <~~N+R3 erősen szubsztituens (R) függő

7. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA IONCSERÉLŐ TÖLTETEK KATION CSERÉLŐK Negatív töltésű funkcionális csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4) ANION CSERÉLŐK Pozitív töltésű (primer, vagy szubsztituált, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionális csoportokkal AMFOTER (kevert) TIPUSOK Pozitív és negatív töltésű funkcionális csoportokat tartalmazó komplex szerkezettel IONCSERÉLŐK ERŐS - GYENGE DISSZOCIÁCIÓ FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT „TENTACLE” ELV - KAPACITÁS !

8. IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

9. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS A LEGFONTOSABB MODULÁLÓ TÉNYEZŐK KÉMHATÁS - pH - PUFFEREK AZ IONCSERE EGYENSÚLYI FÁZISÁBAN A MEGFELELŐ ELLENION ÉS AZ IONCSERÉLŐ TÖLTÉSÉNEK BIZTOSÍTÁSA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) TÖLTÉSÉNEK KIALAKÍTÁSA (pozitív, vagy negatív, pl. fehérjék) AZ IONCSERE pH-val MODULÁLT ELÚCIÓS FÁZISÁBAN AZ ELVÁLASZTANDÓ VEGYÜLETEK ÉS AZ IONCSERÉLŐ IONOS KÖLCSÖNHATÁSAINAK SZELEKTÍV MEGVÁLTOZTATÁSA

10. A kationcserélő kromatográfiában használt pufferek

11. Az anioncserélő kromatográfiában használt pufferek (klorid, ill. K-Na só)

12. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS • IONERŐSSÉG (I) - IONMINŐSÉG összefüggésből számítható, ahol:

13. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS • POLARITÁS AZ ÁRAMLÓ FÁZIS POLARITÁSÁNAK VÁLTOZTATÁSA (CSÖKKENTÉSE) ADALÉK OLDÓSZEREKKEL METANOL, ACETONITRIL AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK ERŐSSÉGÉNEK VÁLTOZTATÁSA

14. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA MUNKAFOLYAMATAI

15. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA EGYENSÚLYI ÁLLAPOT BEÁLLÍTÁSA (EKVILIBRÁLÁS) AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAGOK KÖTŐDÉSÉRE AZ EGYÉB (KONTAMINÁNS) ANYAGOK ELKÜLÖNÍTÉSÉRE A MEGFELELŐ ÁLLÓ FÁZIS KIVÁLASZTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK OPTIMÁLÁSA pH, IONERŐSSÉG-MINŐSÉG, POLARITÁS KEMOSZORPCIÓ AZ ÁRAMLÓ FÁZISBANOLDOTT MINTA KÖLCSÖNHATÁSBA HOZÁSA AZ ÁLLÓ FÁZISSAL AZ EGYÉB (NEM KÖTŐDŐ) ANYAGOK LEOLDÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZISSAL (ELÚCIÓ)

16. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA A DESZORPCIÓ MŰVELETEI(ELVÁLASZTÁS, FRAKCIONÁLÁS) AZ IONOS KÖLCSÖNHATÁSOK SZELEKTÍV MEGBONTÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS PARAMÉTEREINEK pH, IONERŐSSÉG, POLARITÁS SZISZTEMATIKUS SZAKASZOS és/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJŰ vagy KÜLÖNÁLLÓ VÁLTOZTATÁSÁVAL IZOKRATIKUS ELUCIÓ GRADIENS ELUCIÓ AZ ELUENS PARAMÉTEREINEK VÁLTOZTATÁSA SZAKASZOS - LÉPCSŐZETES LINEÁRIS, vagy EGYÉB (KONVEX, KONKÁV, stb.) FÜGGVÉNYKAPCSOLAT SZERINT

17. IONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA GRADIENS KÉPZÉS (pH, IONERŐSSÉG, KONCENTRÁCIÓ, POLARITÁS) pH B > A A B V

18. Jel (AU) I pH A B C D V0 (t0) Elúciós térfogat (idő) A GRADIENS ELÚCIÓ ÉS FÜGGVÉNYKAPCSOLATAI

19. Példa a gradiens elúció hatására

20. 21 TERMÉSZETES AMINOSAV IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA Dionex DC-6A ANIONCSERÉLŐ OSZLOPON (30X0,46 cm) 3 LÉPÉSES Na-citrát gradiens PROGRAMMAL DETEKTÁLÁS: NINHIDRIN (post-column)

21. TERMÉSZETES AMINOSAVAK FMOC SZÁRMAZÉKAINAK ELVÁLASZTÁSA IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL

22. FEHÉRJE MOLEKULA SZERKEZETÉNEK IONOS, VAGY IONIZÁLHATÓ FUNKCIONÁLIS CSOPORTJAI

24. CELLULÁZ TRIPSZINES EMÉSZTÉSI TERMÉKEINEK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL

25. KÍGYÓMÉREG ÖSSZETEVŐINEK ELVÁLASZTÁSA KATIONCSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

26. HbA1C ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE KATIONCSERÉLŐ (Mono S) KROMATOGRÁFIÁVAL

27. HUMÁN SZÉRUM LAKTÁT DEHIDROGENÁZ IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA HORIZONTÁLIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZISSEL

28. LAKTÁT DEHIDROGENÁZ (LDH) IZOENZIMEK ELVÁLASZTÁSA KATION CSERÉLŐ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

29. VIZELET FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA ANIONCSERÉLŐ (Mono Q) KROMATOGRÁFIÁVAL

30. - LIGHT CHAINS FEHÉRJE KIMUTATÁSA KÓROS VIZELETBEN (MYELOMA MULTIPLEX)

31. 100 AU280 B % AGP HSA 50 Globulinok Idő (perc) Humán szérumból folyadék-folyadék fázisú extrakcióval nyert vizes-metanolos fázis savanyú alfa-1-glikoprotein (AGP)tartalmának elválasztása és tisztítása ioncserélő folyadékkromatográfiával Fractogel EMD TMAE 500M oszlopon (5X0.5 cm) gradiens elúcióval (A-puffer: 5 mM NaH2PO4 pH: 6.5, B-puffer: 350 mM NaCl A-pufferben). Szaggatott vonal: gradiens program, Egyéb szennyező fehérjék: HSA: humán szérum albumin, Globulinok.

32. MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás, felülúszó semlegesítve KHCO3-al FPLC oszlop: MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5 Áramló fázis: NH4-foszfát puffer, pH: 7, 0 Gradiens elúció: 0,1 – 1, 0 M Program szerint Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE IONCSERÉLŐ MonoQ – FPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

33. NUKLEOZIDOK ÉS NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSA ION-PÁR HPLC FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL (Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) MINTAELŐKÉSZÍTÉS: Szövetek, sejtek, biológiai folyadékok homogenizálva 0,7M perklórsavban, centrifugálás felülúszó semlegesítve KHCO3-al HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: 0,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 és 0,08M NaCl Lineáris gradiens elució: MeOH 0-20% (v/v) 45perc Áramlási seb: 0,75 mL/perc Detektálás: 254 nm

34. A HPLC-ION PÁR KROMATOGRÁFIA PARAMÉTEREINEK ÖSSZEFÜGGÉSE k’VÁLTOZÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH ÉS NaCl TARTALMÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN A NUKLEOTID FOSZFÁTOK ELVÁLASZTÁSÁNAK OPTIMÁLÁSA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS MeOH és/vagy NaCl KONCENTRÁCIÓJÁNAK VÁLTOZTATÁSÁVAL HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) Áramló fázis: 0,025M TBAH-foszfát pH: 6,0 (Optimálisan) 0,08M NaCl

35. NÉHÁNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

36. NÉHÁNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA

37. Köszönöm a figyelmet

38. HUMÁN SZÉRUM AGP ELVÁLASZTÁSA ÉS MÉRÉSE ANIONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIÁVAL KETTŐS pH – NaCl GRADIENSSEL pH 7,5  9,5 NaCl 0  350 mM