Laboratorní diagnostika chlamydiových infekcí a její interpretace

1. Laboratorní diagnostika chlamydiových infekcí a její interpretace Naděžda Sojková a kol. Zdravotní ústav se sídlem v Praze Oddělení virologie

2. Chlamydie • Unikátní biologické vlastnosti : • nitrobuněční „energetičtí parazité“ • bez schopnosti syntetizovat ATP • Struktura podobná G- bakteriím, ale liší se: • nemají ve stěně k. muramovou • mají více lipidů • rigidní buněčná stěna • LPS méně toxický a imunologicky méně účinný při indukci zánětu

3. Růstový cyklus • I. Optimální růstové podmínky • infekční elementárnítělísko (EB, 250-400 nm) • vstup do buněčného fagosomu • inhibice fagolysosomální funkce • EB se zvětší a transformují v metabolicky aktivní : • neinfekční retikulární tělísko (RB, 800-1000 nm) • binární dělení ( po 16-24 hod) • spotřeba ATP hostitelské b. a kondenzace opět v EB • za 48-72 hod je cytoplasma naplněna EB a praská • (popř.exocytóza) • výsev infekčních částic

5. II. Zhoršené růstové podmínky • (Chybná strategie léčby, produkce prozánětlivých cytokinů- IFNgama) • Přerušení vývojového cyklu • vznik aberantních tělísek s alterovanou expresí genů • zejména cHSP- exprimován na úkor MOMP, OMP.. • vznik chronických (perzistentních) infekcí (deregulace imunity - fibroproduktivní zánět, reaktivita pacienta- genetika) • EB z chronicky infikovaných buněk se uvolňují • exocytózou

7. Klasifikace a klinické projevy • Chlamydiacae – 2 rody: Chlamydia • Chlamydia trachomatis (1907) – 18 sérotypů • Urogenitální trakt: lymfogr. venereum (L1-3), • negonokoková urethritis, epididymitis, cervicitis, • endometritis, salpingitis, periadnexitis (D-K) • Oko: trachom , inkluzní konjunktivitis (A-C) • Neonatální infekce: konjunktivitida, otitida, pneumonie • Projevy chronické infekce: chronický urogenitální zánět, • poruchy reprodukce, akutní perihepatitida, chronická • proktitida, chlamydiová a postchlamydiová reaktivní • artritida, Reiterův syndrom

8. Chlamydophila (od r. 1999) • Chlamydophila pneumoniae(1965): • 50-80% promořenost dospělé populace • Akutní infekce: nejčastěji HCD • pneumonie, bronchitida, sinusitida • ale také konjunktivitida • běžné jsou reinfekce (uplatňuje se spíše sekreční • imunita) • Komplikace akutní infekce: • infekční nebo reaktivní artritida • meningoencefalitida • endokarditis, myokarditis, perikarditis • syndrom Guillain-Barré

9. Perzistentní infekce: • vztah k etiologii astma bronchiale, CHOPN, • arterioskleróze, aortálním aneurysmatům • Projevy chronické infekce: • exacerbace astma bronchiale, chron. obstr. • bronchitida, reaktivní artritida • Studován vztah k: arterioskleróze • bronchopulmonálnímu karcinomu • onemocněním CNS včetně • indukce RS

10. Chlamydophila psittaci: • Antropozoonóza - „ornitóza“ (obecně) • - „psitakóza“ (papouščí nemoc) • nositelem infekce jsou ptáci (holubi, papoušci) • ale také savci ( koně, ovce, skot , kočky) • u člověka se nákaza vyskytuje sporadicky • atypická pneumonie, myokarditida, hepatitida, • hepatosplenomegalie

11. Základní zásady terapie chlamydiových nákaz: • Chlamydie • – nejvyšší citlivost k makrolidům a tetracyklinům. • Podmínky: • co nejnižší MIC • vysoký průnik do tkání (prostřednictvím makrofágů • do místa zánětu) • dosažení účinných hladin v endosomu • dlouhodobé působení (2-3 týdny) • Vše optimálně splňuje Doxycyclin a Azithromycin • (Sumamed, Zetamac) • Kombinace s metronidazolovými preparáty-Entizol • Podpůrná enzymoterapie

12. Důležité chlamydiové antigeny • Major outer membrane protein, MOMP: • druhově specifický antigen na povrchu EB • Lipopolysacharid, LPS: • rodově specifický , tj společný všem druhům Ch. • působí prozánětlivě jako polyklonální aktivátor • makrofágů a lymfocytů • Chlamydiový heat-shock protein, c-HSP: • fylogeneticky konzervovaný prozánětlivý protein • indukce protrahované DTH • schopnost navození autoimunitních procesů

13. Laboratorní diagnostika • Jak?Antigen? Materiál? • Přímáhybridizace DNA výtěry, BAL, punktát • PCR moč, likvor, • biopsie, etc. • DIF MOMP, LPS • 2. NepřímáKFR ELISA LPS (genus), MOMP,HSP krev • MIF MOMP (EB-species) • immunoblot MOMP,OMP2,TARP • CPAF, HSP60, YwbM

14. Diagnostické metody, testy: 1. genus–specifický test : Anti-Chlamydia IgG, IgM and IgA - LPS antigen – LPS-ELISA 2. MIF SeroFia - species–specifický test : Anti-Chlamydophila pneumoniae (CP) a psittaci CPs , Chlamydia trachomatis (CT) IgG, IgM a IgA protilátky proti MOMP EB - MIF metoda. 3. recomLine Chlamydia IgG, IgA a IgM test.

15. Přínos metody recomLine • vysoká specificita pro všechny 3 druhy chlamydií • species specifické antigeny CPAF-faktor virulence, TARP-vazba actinu a YwbM pro CP • HSP60 indikátor chronických infekcí • vyšší senzitivita IgA protilátek, zejména u CP a CPs • jediná vysoce specifická metodika pro sérologii CPs • vedle IgG a IgA další třída protilátek IgM • možnost automatizace • současné použití jak pro screening , tak pro konfirmaci výsledků • jednokroková diagnostika všech 3 druhů chlamydií • rekombinantní antigeny vylučují zkříženou reaktivitu

16. New recomLine Chlamydia- examples of positive sera- C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci OMP2 YWBM MOMP HSP60 TARP CPAF MOMP MOMP OMP2 OMP2 TARP CPAF TARP CPAF A IgG C. trachomatis infection: IgG, IgA and IgM positive; IgM IgA B IgG C. pneumoniae infection: IgG, IgA and IgM positive IgM IgA C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA and IgM; additional past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae IgG C IgM IgA

17. New recomLine ChlamydiaChlamydia trachomatis positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci OMP2 YWBM MOMP HSP60 TARP CPAF MOMP MOMP OMP2 OMP2 TARP CPAF TARP CPAF A IgG typical past C. trachomatis infection with slight cross-reactivity to C. pneumoniae and C. psittaci IgM IgA B IgG double infection with C. trachomatis and C. pneumoniae verified by TARP (C. trachomatis) and CPAF and YWBM (C. pneumoniae); IgA positive IgM IgA IgG C C. trachomatis infection; might be a recent infection due to positive IgM IgM IgA

18. New recomLine ChlamydiaChlamydia pneumoniae positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci YWBM TARP OMP2 TARP CPAF HSP60 MOMP MOMP MOMP OMP2 OMP2 CPAF TARP CPAF IgG A typical C. pneumoniae infection; IgA positive IgM IgA IgG B typical C. pneumoniae infection; might be a recent infection due to positive IgM IgM IgA IgG C double infection with C. pneumoniae and C. trachomatis verified by YwbM (C. pneumoniae) and TARP and CPAF (C. trachomatis) IgM IgA

19. New recomLine ChlamydiaChlamydia psittaci positive sera C. trachomatis C. pneumoniae C. psittaci YWBM HSP60 MOMP MOMP MOMP OMP2 OMP2 OMP2 TARP CPAF TARP CPAF TARP CPAF A IgG C. psittaci infection confirmed by the MOMP reactivity in IgA; additional past infections with C. trachomatis and/or C. pneumoniae IgM IgA B IgG acute infection with C. psittaci proven by MOMP IgM; past infection with C. pneumoniae that (TARP, CPAF and YwbM) IgM IgA IgG C no C. psittaci infection (as has been determined by MIF); past infections with C. trachomatis and C. pneumoniae IgM IgA

20. Interpretace sérologických nálezů 1.Přítomnost protilátekanti LPS – rozdělení do infekčních stadií: Pouze IgM popř. IgA – v.s. akutní infekce-primoinfekce/reinfekce pouze IgG (+/++) – anamnestická odpověď IgG (+++) a IgA (+/++) – recentní , v.s. aktivní infekce 2. Potvrzení/vyloučení aktivní infekce – stanovení anti MOMP: Species-specifický test-MIF: titr IgG 1:512 a vyšší-známka aktivní infekce Titr IgA 1:64 – potvrzení aktivní infekce Sporné nálezy – konfirmace immunoblotem 3. IgG anti-cHSP60 protilátky: v.s. chronická infekce, potvrzení opakovaným vyšetřením, popř. immunoblotem

21. Výsledky Porovnání infekčních stádií u pacientů s MS a v CG – Elisa, MIF

22. p = 0,003; ODR = 11,25 p = 0,61; ODR = 0,89

23. Závěr • Pro rychlou a přesnou diagnostiku akutních infekcí má větší význam přímý průkaz patogena ve vhodně voleném materiálu. • Pro screeningové vyšetření je vhodná sérologie založená na protilátkové odpovědi anti-LPS. • 3. Průkaz protilátek proti MOMP je významně důležitějším markerem v diagnostice chronických aktivních chlamydiových infekcí než protilátky proti LPS. • 4. IgG anti cHSP60 jsou významným markerem pro potvrzení a sledování perzistentní infekce. • 5. Dokladem neustálého zpřesňování diagnostiky je nový test recomLine s rekombinantními antigeny TARP, CPAF a YWBM. • 6. Výsledky naší spolupráce s klinickými pracovišti potvrzují, že stavům chronické a perzistentní infekce lze předcházet systematickým vyšetřováním, které společně s klinickým stavem pacienta pomáhá lékaři stanovit správnou diagnózu a léčbu akutních infekcí.