Universität Bielefeld SFB 613

1. Universität Bielefeld SFB 613 A5 Assemblierung, funktionelle Dynamik und Regulation des multiheteromeren Proteinkomplexes der vakuo-lären H+-ATPase T. Seidel1, D. Schnitzer1, E. Buck2, B. Seefeldt2, M. Hanitzsch1, D. Golldack1, P. Tinnefeld2, M.Sauer2, K.J. Dietz1 1 Lehrstuhl für Biochemie und Physiologie der Pflanzen, Fakultät für Biologie; 2 Angewandte Laserphysik, Fakultät für Physik • Ziele • Identifikation von Assemblierungsfaktoren • Bestimmung der Reihenfolge der Untereinheiten-Interaktionen während der Assemblierung • Untersuchung regulatorischer Interaktionen mit weiteren vakuolären Transportern (Pyrophosphatase, Ca2+-ATPase, Chloridkanäle) • Redoxregulation: Identifikation von Regeneratoren und Analyse der Interaktion • Strukturelle Analyse der V-ATPase unter Berücksichtigung von 14-3-3 Proteinen, Aldolase und des Cytoskeletts • Visualisierung der katalytischen Dynamik und Kompartiment- spezifische Bestimmung der Dichte der V-ATPase • Vergleich der Reversiblen Dissoziation in Pflanzen und Hefe • Arbeitsplan • Fortsetzung der Charakterisierung fluoreszierender Proteine für in vivo und in vitro Analysen im Hinblick auf Einzelmolekülspektroskopie • Herstellung von Fusionskonstrukten aus VHA- • Untereinheiten und fluoreszierenden Proteinen, u.a. für die Analyse der katalytischen Dynamik • Etablierung hochauflösender Mikroskopie in • Pflanzenzellen mittels Photoswitching Microscopy mit Actin-Dronpa und farbstoffmarkierten Antikörpern. • AFM-Kraftspektroskopie zur vergleichenden Analyse der V1-V0 Interaktion in Pflanze und Hefe • Visualisierung der Rotation mittels FRET zwischen splitDronpa (Proteolipid) und VHA-a-mCherry • Immunpräzipitation, Y2H und Streptag-Affinitäts-chromatographie zur Identifikation von Interaktionspartnern und Regeneratoren. • Kompetitiver BiFC-Ansatz für die Analyse der sukzessiven Protein-Interaktionen während der Assemblierung • Charakterisierung von Interaktionen mittels FRET und • BiFC Hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie mit optisch schaltbaren Farbstoffen. Actin-Filamente markiert mit Cy5-Phalloidin unter dSTORM-Bedingungen und schematische Darstellung der AFM-Kraftspektroskopie. Resultate Struktur des Sektors V0 Der membranständige Subsektor V0 besteht primär aus einem Ring der Proteolipide VHA-c und VHA-c“ sowie der Untereinheit VHA-a. Die Funktion der Untereinheiten VHA-d und VHA-e ist bisher nicht aufgeklärt. Lokalisations-experimente ergaben, dass beide Isoformen von VHA-c“ und VHA-e2 im ER lokalisiert sind, während VHA-e1 in endosomalen Strukturen detektiert wurde. Folglich existieren drei Isoenzyme der V-ATPase in der pflanzlichen Zelle. FRET-Messungen ergaben zudem, dass VHA-c“ mit einer Kopie im Komplex vorliegt, während VHA-e mit mindestens zwei Kopien nachgewiesen wurde. Diese Daten weisen auf eine Funktion von VHA-c“ und VHA-e im Targeting oder in der Assemblierung hin. Der D Superresolution Fluoreszenzimaging zur Dichtebestimmung Lokalisation von VHA-c“ (A) und VHA-e2 (B) Durchmesser des Proteolipidrings konnte zudem durch den Einbau trunkierter Proteolipid-Untereinheiten reduziert werden. Mit Hilfe der Photoswitching Microscopy kann die Beugungsgrenze der optischen Mikroskopie durchbrochen werden und Strukturen mit einer lateralen Auflösung von ca. 20 nm abgebildet werden. Die Methode kann aber ebenso zur Abstands- und Dichte-bestimmung bestimmter Proteine in subzellulären Strukturen verwendet werden. FRET-Effizienzen zwischen V0-Untereinheiten Struktur des peripheren Stiels FRET-Analysen zeigen einen bevorzugten Energietransfer der VHA-G-Isoformen zum ubiquitär vorkommenden VHA-E1, wie auch zwischen den beiden pollenspezifisch exprimierten Isoformen VHA-E2 und –G3. Des Weiteren zeigt die Untereinheit VHA-C keinerlei Spezifität in der FRET-Effizienz mit den Isoformen der Untereinheit VHA-G. Auf eine isoformspezifische Regulation weist der ausbleibende Energietransfer zwischen VHA-E2 und –C hin, da die anderen Isoformen von VHA-E eine FRET-Effizienz von etwa 20 % aufzeigen. Prinzip der hochauflösenden Fluoreszenz-mikroskopie mit optisch schaltbaren Farbstoffen. Im Beispiel sind F0F1 ATP Synthasen in der Mitochondrienmembran mit einem Cy5-markierten Fab-Fragment markiert worden und mittels dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) aufgenommen worden. (TIRF-Mikroskopie; Gleichzeitige Anregung mit 0.5 mW 514 nm und 24 mW 647 nm). Ergänzungs-Ausstattung Personalmittel: Eine Doktorandenstelle je beteiligter Arbeitsgruppe (E. Buck, D. Schnitzer) Vernetzung innerhalb des SFB D7, D12, A8, D11, K5, A2, K8, A6 Publikationen [1] T. Seidel, D. Golldack and K.J. Dietz “Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements” FEBS Lett. 579: 4374-4382, 2005 [2]M.A. Kader, T. Seidel, D. Golldack and S. Lindberg “Expression of OsHKT1, OsHKT2, and OsVHA are differentially regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salt-tolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars” J. Exp. Bot. 57: 4257-4268, 2006 [3]M.A. Kader, S. Lindberg, T. Seidel, D. Golldack and V. Yemelyamov “Sodium sensing induces different changes in free cytosolic calcium concentration and pH in salt-tolerant and -sensitive rice cultivars” Physiologia Plantarum 130: 99-111, 2007 [4]M.Hanitzsch, D. Schnitzer, T. Seidel, D. Golldack and K.J. Dietz “Transcript level regulation of the vacuolar H+-ATPase subunit isoforms VHA-a, VHA-E and VHA-G in Arabidopsis thaliana” Mol. Membr. Biol. 24: 507-518, 2007 [5]J. Ross, P. Buschkamp, D. Fetting, A. Donnermeyer, C.M. Roth and P. Tinnefeld “Multicolor single-molecule spectroscopy with alternating laser excitation for the investigation of interactions and dynamics” J. Phys. Chem. B. 111: 321-326, 2007 [6]B. Seefeldt, M. Heilemann, P. Tinnefeld, T. Seidel, K.J. Dietz and M. Sauer “A comparative single-molecule fluorescence study: Photostability and blinking of fluorescent proteins” J. Biophotonics 1: 74-82, 2008 [7]T. Seidel “Review: Structure and Regulation of Plant V-ATPase” Progress in Botany. Accepted manuscript, 2008 [8]T. Seidel, D. Schnitzer, D. Golldack, M. Sauer and K.J. Dietz “Organelle-specific isoenzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET analysis” BMC Cellbiol. Accepted manuscript, 2008 [9]C. Neubert, L. Graham, E.W. Black-Maier, T.Y. Liu, Y.D. Stierhof, T. Seidel, T.H. Stevens and K. Schumacher “Arabidopsis has two functional orthologs of the yeast V-ATPase assembly factor Vma21p” Traffic doi: 10.1111/j.1600-0854.2008.00799.x, 2008

2. Glucose Die Diagramme zeigen die gewebe- und stressspezifische, prozentuale Verteilung der VHA-Isoformen (grau: Isoform 1, schwarz: Isoform 2, weiss: Isoform 3). Kontrolle (C), Salzstress (SS), osmotischer Stress (OS), Kältestress (CS), Hitzestress (HS) und Trockenstress (DS). Blatt (l), Wurzel (r), Stiel (st), Blattstiel (pe), Pollen (po), Blüte (f), Keimling (se) und Gesamtpflanze (wp). Universität Bielefeld SFB 613 A5 Zusatzinformation Redox-Regulation Die V-ATPase erwies sich als sensitiv gegenüber oxidierenden Bedingungen. Innerhalb der katalytischen Untereinheit VHA-A sind die Cysteine C256, C279 und C535 in allen Eukaryoten konserviert. In Zusammenarbeit mit K. Schumacher (Uni Heidelberg) wurde die oxidierende Hemmung anhand der A. thaliana Linien C256S, C279S und C535S im VHA-A Deletionshintergrund untersucht. Regulation der V-ATPase Reversible Dissoziation Regulation der vakuolären H+-ATPase unter Glucosemangel Pollenspezifische Regulation der vakuolären H+-ATPase Die Messungen ergaben, dass eine Hemmung einzig durch die Mutation C256S aufgehoben wird. C256 ist im P-Loop des aktiven Zentrums lokalisiert. Dies belegt, dass keine intramolekulare Disulfidbrücke ausge-bildet wird. Transkript-Regulation Semi-quantitative RT-PCR (links) und Array-Hybridisierungen (rechts) zeigen gewebespezifische Expressionen der Isoformen VHA-E2 und VHA-G3 aus A. thaliana in Pollen bzw. Blüte. Die beiden übrigen Isoformen der Untereinheiten werden gewebeunspezifisch exprimiert. Außerdem kann eine Erhöhung der VHA-E2- und VHA-G3-Transkripte unter Hitze- und Trockenstress beobachtet werden. FRET-Messungen der Konstrukte VHA-E1/-C und VHA-E3/-C zeigen eine räumlich Nähe der jeweiligen Untereinheiten, während zwischen VHA-E2 und VHA-C kein Energie-transfer nachzuweisen ist. FRET-Messungen haben gezeigt, dass der Energietransfer zwischen den Untereinheiten VHA-E und VHA-C unter Einwirkung von 2-Desoxyglucose reduziert ist. Eine chaotrope Dissoziation der V-ATPase mittels Kaliumiodid kann bei der pflanzlichen V-ATPase nur bedingt festgestellt werden, da trotz 1 M KI-Behandlung noch über 40 % der Proteine im Komplex gebunden vorliegen. Diese Ergebnisse weisen auf eine hohe Stabilität der pflanzlichen V-ATPase hin. Analyse fluoreszierender Proteine Charakterisierung von GFP- und DsRed-Derivaten Die GFP-Derivate CFP, YFP und T-Sapphire als auch die DsRed-Derivate DsRed2, mCherry und mOrange wurden hinsichtlich ihrer Photostabilität in Einzelmolekülmessungen untersucht. mCherry erwies sich hierbei als aussergewöhnlich photostabil. Seine spektralen Eigenschaften weisen es zudem als geeigneten Akzeptor für FRET-Messungen mit YFP als Donor aus. 2-step FRET Das bestehende FRET-Paar CFP-YFP wurde um mCherry aus der mFruits-Proteinfamilie erweitert. mCherry wurde aufgrund einer geeigneten Überlappung seines Anregungsspektrums mit dem Emissionsspektrum des YFP, der kurzen Maturationszeit und seiner hohen Photostabilität als Akzeptor gewählt. Referenz-Messungen Referenzmessungen dienten der Quantifizierung des Über-sprechens von CFP und YFP z.B. in den 2-step FRET-Kanal und zur Quantifizierung der Direktanregung von YFP und mCherry bei 458 und 514 nm. Die Messung des 2-step FRET in Zellen, die mit CFP, YFP und mCherry cotransformiert wurden, diente als Negativkontrolle. Im nächsten Schritt wurden Tandemproteine aus CFP, GFP, YFP und T-Sapphire fusioniert mit mCherry hergestellt, um diese als mögliche Donatoren für mCherry auf Einzelmolekül-ebene zu testen. 0.9% 0% 8.3% 33% 11% 9,7% Die Messung der FRET-Effizienzen erfolgte über die Quantifizierung der Donorfluoreszenz. Auch in diesen Messungen erwies sich YFP als der geeignetste Donor für mCherry. Das dekamere 2-Cystein Peroxiredoxin als Modellsystem Das 2-Cystein Peroxiredoxin (2-Cys Prx) wechselt in vitro während des katalytischen Zyklus zwischen einer dimeren oxidierten und einer dekameren reduzierten Form. 2-step FRET wurde angewendet, um die dekamere Form in lebenden Zellen nachzuweisen. Die Energietransferrate von CFP über YFP zu mCherry betrug 11%, während in der Negativkontrolle kein Energietransfer feststellbar war.