La methode de execution de section fines pour la microscopie photonique

1. La methode de execution de section fines pour la microscopie photonique

2. La methode de execution de section fines pour la microscopie photonique Étapes: • Prélèvements de tissus ou des cellules • Fixation par des méthodes physiques ou chimiques • Enrobage avec du plastique, des résines, ou à la paraffine • Confection des coupes (microtomie) et montagesur lame

3. Matériel d'étude • Prélèvements cellulaires : étude cytopathologique • Le recueil de cellules isolées peut constituer : - un examen de dépistage en l'absence de symptômes, dans une population particulièrement susceptible d'être atteinte d'une affection - un examen diagnostique, - une méthode de suivi post-thérapeutique. • Il est réalisé : - par raclage (frottis) d'une muqueuse (col utérin, vagin) ou de la peau - par ponction d'un liquide normal ou pathologique (liquide céphalorachidien, sang, ascite, liquide pleural...) examiné après cytocentrifugation - par recueil d'un produit de sécrétion, urines, lavage bronchiolo-alvéolaire, examiné après cytocentrifugation - par cytoponction à l'aiguille fine, d'un organe plein ou d'un kyste, parfois de façon dirigée, sous échographie ou scanner - par apposition sur lame d'un fragment tissulaire avant sa fixation.

4. Matériel d'étude Prélèvements tissulaires : étude histopathologiqueLa biopsie est le prélèvement d'un fragment de tissu chez un être vivant. Elle permet l'examen d'une partie (biopsie partielle) ou de la totalité (biopsie exérèse) d'une lésion. Elle est faite :- sous contrôle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces, en surface ou au cours des endoscopies (gastrique, bronchique, colique : cœlioscopie...), - à l'aiguille (ponction-biopsie) dans les organes profonds La pièce opératoire est le résultat d'un acte chirurgical avec résection d'un ou plusieurs organes. Son étude comporte un bilan macroscopique des lésions (nombre, siège, aspect), qui peuvent faire l'objet de photographies macroscopiques, et la réalisation des prélèvements nécessaires à l'examen microscopique.L'examen extemporané est une technique rapide qui permet, au cours d'une intervention chirurgicale, de donner un résultat histologique en moins de 20 minutes. Il s'effectue par congélation d'un fragment tissulaire, coupe et coloration simplifiée. Il est moins précis que la technique histopathologique standard, qui doit toujours le compléter, après le délai habituel de fixation et la procédure de routine. Il est indiqué lorsque son résultat peut modifier l'acte chirurgical. L'autopsie (ou nécropsie) est un examen fait chez un patient décédé pour préciser les lésions responsables des symptômes observés, établir les causes médicales immédiates de la mort et juger éventuellement de l'effet des traitements appliqués.Les prélèvements animaux peuvent être l'objet d'une étude anatomo-pathologique, en médecine vétérinaire ou au cours d'une expérimentation.

5. Fixation par des méthodes physiques • La dessication est une des méthode la plus simple. Elle consiste a laisser I’eau s’ évaporer a l’air libre et a température ambiante. • La sublimation consiste a faire évaporer la glace. Elle suppose d’abord une transformation de l’eau en glace par congélation, ensuite une sublimation de la glace. • Il existe une troisième possibilité qui consiste a remplacer l’eau par un solvant miscible a I’eau : alcool éthilique, méthilique, ou l’acétone. Cette technique s’appelle la déshydratation.

6. Principe de la substitution,imprégnation,et enrobage en mode cryogénique • Dans le cas de l’echantillon congelé, la substitution se fait à basse température, la glace est progressivement remplaceé par de l’alcool ou de l’acétone. On ne revient pas a la phase liquide de l’eau pour éviter la migration des ions et toutes les redistributions qui se produisement dans cet état. On évite également la transformation de la glace vitreuse en glace cubique ou hexagonale qui détruit les structures. • Pour que la substitution puisse s’effectuer dans un délai correct, on pratique cette opération sous l’action du vide (a -90 degrès C). La glace est extraire par le vide et se dissout dans le solvant; ce dernier ce pénetre peu a peu au coeur de l’ échantillon. Apres , on augmente régulierement la température pour assure une totale substitution de la glace. Principe de la cryo-sublimation • La tension de vapeur de la glace est liée a la température et a la pression. Lorsqu’on augmente la témperature, donc la tension de vapeur, on accélère • l’ évaporation de la glace. Il est aussi nécessaire de diminuer la pression pour obtenir le même effet.

7. Fixation par des méthodes chymiques • Pour que les composantes soient préservées, les tissus doit être traité avec des produits chimiques qui en empêchent la détérioration. Les produits chimiques employés s'appellent fixateurs, préparés en solution. • La fixation s'effectue: • par immersion (en baignant dans le fixateur les pièces des tissus - avec des dimensions de 1 mm) • par perfusion (en remplaçant par le fixateur le sang de l'animal anesthésié, par perfusion transcardiaque)

8. Principe de la fixation chimique • La fixation chimique consiste a ponter les protéines. • Il s’ensuit une dénaturation des protéines et une perte de tous les élements diffusibles de petites dimensions. • Les fixateurs chimiques s'unissent aux protéines des tissus ou les dénaturent et les précipitent en remplaçant l'eau qui leur est associée. • En dénaturant les protéines, la fixation chimique bloque les systemes enzimatiques, ce qui empeche toute détérioration ultérieure du matériaux par autolyse. • Le fixateur se lie aux protéines par réaction d’addition au niveaux de doubles liaisons ou de groupements alcool, aldéhyde ou hydroxyle. • Les fixateur utilisés sont des aldéhydes (paraformaldéhydes, glutar aldéhydes) ou des puissants oxydants (tétroxyde d’osmium), seuls ou en combinaison avec d'autres produits. Certains fixateurs spéciaux peuvent être employés pour la préservation de composantes tissulaires spécifiques. • Les aldéhiyes sont des bons fixateurs des protéines et des acidés nucléiques.

9. ENROBAGE • Il est difficile de couper un organe fixé en tranches suffisamment minces pour être observables au microscope. Puisqu'un un bloc de cire peut être tranché très finement. Cette méthode permet d'obtenir des coupes d'organes aussi minces que 5µm. • Comme la paraffine n'est pas miscible avec l'eau contenue dans l'organe et le fixateur, il faut déshydrater l'organe dans des bains successivement plus concentrés d'éthanol, puis d'éthanol absolu; c'est le processus de déshydratation. Puisque l'alcool n'est pas miscible avec la paraffine, l'organe infiltré d'alcool doit être baigné dans du dioxane ou du xylène avant d'être placé dans des bains de paraffine liquide. Dioxane et xylène sont miscibles tant dans l'alcool que dans la paraffine. Une fois l'enrobage achevé, c'est à dire que l'organe est infiltré et enrobé de paraffine et le dernier bain de paraffine est refroidi, on obtient un bloc qui sera facilement débité.

10. Principe de la déshydratation • La déshydratation consiste a remplacer progressivement l’eau par un solvant. Ce dernier doit être a la fois miscible a l’eau et la rèsine d’inclusion. Parfoi il faudra utiliser deux solvants successifs, le premier miscible a l’eau et le deuxieme miscible au premier et a la résine. Ces solvants sont des alcools, de l’acétone ou des composés aromatiques. • La déshydratation se fait très progressivement dans des bains successifs de solvant de plus en plus concentrés. Elle se termine dans des bains de solvant pur.

11. Etapes de la technique de déshydratation • La déshydratation car l’eau et la paraffine ne sont pas miscibles. Elle doit être progressive, par des alcools à 60, 80, 95 et 100° alcool absolu, afin que les fluides se substituent les uns aux autres jusqu’à l’imprégnation dans la paraffine. L’alcool utilisé en technique courante est l’alcool éthylique. Il peut être dénaturé par du méthanol ou de l’alcool isopropylique afin de le rendre impropre à la consommation et de réduire les coûts de fonctionnement. Il est possible également pour les premiers postes d’utiliser des alcools recyclés. •   Un éclaircissement doit être fait par du Xylène, Toluène ou Méthylcyclohexane (MCH), l’alcool et la paraffine n’étant pas miscibles. Ce dernier est moins toxique que le Toluène ou le Xylène.

12. Principe de l’impregnation • La qualité des coupes est en grande partie fonction de l’absence de toute trace de solvant dans la paraffine de la coupe : ce résultat est obtenu par la pratique des bains multiples de paraffine, la pièce étant passée dans au moins 3 bains successifs avant le coulage du bloc. Ces bains doivent être fréquemment changés car ils se chargent progressivement de solvants ; le dernier bain doit toujours être constitué de paraffine vierge. La persistance de toluène ou de tout autre agent clarifiant abaisse le point de fusion de la paraffine, rendant donc celle-ci plus molle et moins propre à la coupe et entraîne une dessiccation (par évaporation du solvant) et une rétraction des structures, réalisant l’aspect « cuit » caractéristique des inclusions défectueuses.

13. Etapes de la technique de l’imprégnation • Elle s’effectue dans une paraffine maintenue à l’état liquide par un séjour dans une étuve dont la température est réglée légèrement au-dessus de son point de fusion. Lorsque l’imprégnation est complète, la pièce est retirée et placée dans un bain de paraffine que l’on fait durcir à la température du laboratoire : on obtient ainsi un bloc prêt à être coupé. • La duréede l’imprégnation varie suivant le volume des pièces. Elle est en moyenne de 6 heures au total pour des pièces assez petites, mais est souvent portée sans inconvénients à 24 heures

14. La « mise » en blocs • Une fois les pièces imprégnées de paraffine, il faut les inclure dans un bloc de paraffine afin de permettre la coupe au microtome. C’est l’enrobage qui peut se faire manuellement. Pour cela on peut utiliser,  des barres de Leuckhardt, pièces métalliques en forme de L que l’on pose sur une surface plane et que l’on rapproche plus ou moins selon la dimension de la pièce. Le refroidissementde paraffine amène sa solidification en un bloc prêt à être coupé. Ce refroidissement est généralement obtenu en laissant reposer la paraffine à la température du laboratoire. La finition du bloc après refroidissement et démoulage, doit être retaillé afin de nécessiter un minimum de dégrossissage au microtome et permettre une coupe plus aisée.

15. D’autres méthodes d’inclusion • Inclusion en paraplast (mélange de paraffines purifiées et de polymères plastiques) qui possède de grandes qualités de résistance et d’élasticité. L’inclusion des pièces dans ce mélange est conseillé. Il permet la confection de coupes très fines de tissus durs ou de consistances différentes, avec des résultats d’excellente qualité. • Méthode d’inclusion en celloidine Elle permet une imprégnation des tissus à froid, sans chauffage. Mais c’est une méthode lente sont Nécessaires (plusieurs semaines). Sa consistance autorise des coupes de grandes dimensions (utérus, sein...) et surtout d’encéphale dans les laboratoires de neuropathologie. • Double inclusion en celloidine et en paraffine. Cette méthode comporte certains avantages de la célloïdine (maintien correct de tissus durs et de consistances variées, possibilité de grandes coupes) et de la paraffine (rapidité, coupes fines).

16. ENROBAGE • des barres de Leuckhardt; a température ambiante, la paraffine se solidifie

17. CONFECTION DES COUPES (MICROTOMIE) ET MONTAGE SUR LAME • Le bloc est placé sur la base d'un microtome, appareil muni d'un couteau et d'un mécanisme d'avancement de sa base, qui permet de trancher le bloc à l'épaisseur désirée. Pour des études histologiques routinières, l'épaisseur des coupes varie entre 10 et 20µm. • La méthode décrite ci-haut est la plus commune pour étudier l'histologie générale. Toutefois, il existe d'autres façons de préparer des coupes histologiques. Par exemple, l'organe, fixé ou non, peut être congelé dans de la glace sèche ou de l'azote liquide (qui servent de fixateur) et monté sans enrobage sur un microtome à congélation, ou cryotome. Ainsi congelé, l'organe est suffisamment dur pour être coupé finement. Cette technique présente l'avantage d'obtenir des résultats très rapidement, mais de qualité moindre. L'enrobage d'une pièce d'organe peut se faire avec du plastique ou des résines, plutôt qu'à la paraffine, lorsque des coupes de l'ordre de 1µm ou moins sont désirées. • Afin de pouvoir être observées au microscope, les coupes obtenues sont montées sur des lames de verre préalablement recouvertes de "colle" d'albumine ou de gélatine pour en assurer l'adhérence, puis sont séchées; c'est le montage sur lame.

18. Le microtome Manivelle Support du bloc de paraffine Couteau en acier ruban pinceau scalpel lame

19. Le microtome • TECHNIQUE • reculer le porte objet au maxium • placer le bloc dans le porte objet sans le fixer • placer le rasoir face gravée vers l'extérieur : e fixer (face à couper dans un plan vertical, paralèle au fil du rasoir, les deux arêtes du bloc les plus ongues horizontalement • dégrossir à la main • régler l'épaisseur des coupes (5 microns) • mettre le cliquet • couper (à chaque avancée du couteau, • une coupe est réalisée.L’ensemble des coupes forment un ruban récupéré sur un pinceau).

20. Etalement des coupes sur la lame • Les lames gravées et garnies de ruban de paraffine sont • disposées sur une platine chauffante • Les coupes sont placées dans une étuve dont la température est légèrement inférieure au point de fusion de la paraffine, pendant au moins 30 minutes. Si le tissu est particulièrement fragile, les coupes sont séchées dans une étuve à 37° pendant toute une nuit. Les coupes peuvent alors être colorées.