DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI DEGLI ENZIMI - Vmax E Km

1. DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICI DEGLI ENZIMI - Vmax E Km Saggio enzimatico in saturazione di S: V = K2 [ET] permette di ottenere le U di attività catalitica relative ad un enzima in un campione biologico: U.E. dipendenti direttamente dalla concentrazione di E totale presente; Saggio enzimatico per la determinazione di Vmax e Km: fondamentale in biochimica applicata – affinità dell’enzima per il suo substrato; è il presupposto per lo studio di inibitori e regolatori enzimatici; contribuisce all’ identificazione di isoenzimi,.. Le applicazioni dei saggi enzimatici, oltre ad essere basilari nella ricerca fondamentale biochimica, hanno importanti ricadute in diagnostica clinica e in farmacologia.

2. ENZIMI Gli enzimi sono i biocatalizzatori delle reazioni chimiche all’interno delle cellule. Sono lo strumento principe attraverso il quale si realizzano: metabolismo energetico, biotrasformazioni o processi fondamentali della vita cellulare quali duplicazione del DNA, trascrizione dell’RNA e sintesi proteica. Sono macromolecole biologiche, proteine. Eccezione: i ribozimi, particolari RNA con attività catalitica nelle cellule. Ipotesi interessante: RNA, prime molecole con funzione di catalizzatori biologici, sostituite dalle proteine, strutturalmente più adatte ad esplicare questa funzione: RNA PROTEINE Enzimi proteici: proteine a singola catena polipeptidica; proteine con struttura quaternaria; isoenzimi (ex. LDH) con diversa localizzazione nei tessuti o a livello sub-cellulare Parte proteica apoenzima + parte non proteica oloenzima Coenzimi e cosubstrati: piccole molecole organiche, NADH, NADPH, FADH, biotina, acido lipoico, etc,. Cofattori inorganici: metalli, (Zn, Mg, Cu, Fe..) in metalloenzimi Parte non proteica:

3. PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI • VELOCITÀ DELLE REAZIONI: enzimi aumentano la velocità di reazione fino a 108-1012 volte la velocità in assenza del catalizzatore. Reagente/i = substrato/i. • SPECIFICITA’: gli enzimi hanno un’alta specificità di riconoscimento del substrato in gioco – Specificità degli enzimi è un criterio di classificazione: enzimi a specificità di substrato: stereochimica (riconoscimento degli stereoisomeri); assoluta (una molecola unica); di gruppo (gruppo chimico; ex. metiltransferasi); di legame (un legame chimico, ex. proteasi, legame peptidico). • REGOLAZIONE: gli enzimi sono soggetti a regolazione per adattare l’attività catalitica alle necessità fisiologiche e ai cambiamenti che si attuano nelle cellule. inibizione a feed-back, inibizione da substrato o prodotto, fosforilazione reversibile, • induzione e regolazione dell’espressione genica. • Siti di regolazione - modulazione allosterica: siti di legame con molecole • che modulano l’attività enzimatica. Struttura quaternaria e reg. allosterica. DOMINI E PORZIONI DELLE PROTEINE CON FUNZIONE DI ENZIMA: Sito attivo o catalitico: “tasca” catalitica, dominio dell’enzima che riconosce il substrato e si lega reversibilmente con questo, formando ES. Nel sito catalitico si trovano alcuni residui di AA che sono coinvolti nel meccanismo di catalisi grazie alla natura chimica dei loro gruppi –R. Complementarietà e/o adattamento sterico tra E e S. La conformazione 3D del sito attivo – struttura 3D di tutta la molecola.

4. MECCANISMO DI INTERAZIONE ENZIMA-SUBSTRATO

5. A + B C + D CONSIDERAZIONI ENERGETICHE E CINETICHE G = H – TS Termodinamica chimica: E libera G di reazione, G(P) –G(R) = G G < 0, reazione esoergonica, spontanea da sinistra vs. destra; G > 0, reazione endoergonica, spontanea da destra vs. sinistra; G = 0, all’equilibrio nei due sensi. G0’: variazione di E libera standard, 1 M, a pH 7, Kcal mole-1 reazioni reversibili G = - RT ln Keq + RT ln ([C] [D]/[A] [B]) G0’ = - RT ln Keq , a pH 7 La spontaneità di una reazione chimica o della direzione di un equilibrio chimico dai reagenti ai prodotti e viceversa non ci dice però niente sulla cinetica e la velocità della reazione stessa. E di attivazione: soglia energetica di una reazione chimica; Coordinate di reazione: percorsi e distanza delle specie chimiche in gioco ; Equazione di Arrhenius : k = A e-Ea/RT A= fattore di frequenza, geometria delle molecole; K = cost. di velocità della reazione o vel. specifica di reazione R= costante universale dei gas T= temperatura in Kelvin

6. Teoria dello stato di transizione Tanto è minore l’E att., tanto più la reazione raggiunge facilmente lo stato di transizione e può procede più velocemente nel verso termodinamicamente favorito. Quindi: una reazione può procedere o avvenire + veloc. non per il G tra R e P ma per il valore di Eatt. Anche nella cellula valgono tali principi - le reazioni intracellulari – isobare e isoterme – anche se hanno un G neg. procederebbero comunque troppo lentamente; le reaz reversibili non potrebbero andare in una direzione o in un’altra prontamente per rispondere alle esigenze cellulari: gli enzimi svolgono questa funzione. E(att.) di una reazione chimica con e senza l’enzima • Un enzima: • accelera la reazione; • non è né un R né un P; • -non viene consumato durante la reaz.; • -non sposta l’equilibrio di reaz.; • -non modifica il G complessivo R vs. P • è presente in quantità minime, • non stechiometriche.

7. k1 K2 =Kcat. E + S ES E + P R P K-2 K-1 v0 CINETICA ENZIMATICA Le reazioni del metabolismo energetico avvengono in un verso o in un altro, se sono reversibili, in dipendenza dalle concentrazioni dei reagenti o dei prodotti. Gli enzimi abbassano l’Eatt. delle reazioni senza modificare la direzione della reazione e gli equilibri. k1 Vf = k1 [R], senza enzima K-1 Eq. Henri & Brown Cinetica in stato stazionario: si vede come varia la vel enzimatica a varie [S]; approccio semplificato per studiare la cinetica delle reaz catalizzate da E; - per [E] << [S] - alla velocità iniziale, V0: - [ES] = k K1[E] [S] = k-1 [ES] Alle condiz. fissate di: temperatura, pH,forza ionica, alla v0, pendenza della tangente alla [S] dt, dip. da [ET ].

8. Iperbole di Michaelis & Menten V = Vmax [S]/km + [S] V = K2 [ET] b) -Per [S] << Km V0 dirett. prop. a [S] V = Vmax/Km [S] Reazione che segue una cinetica del 1° ordine; V = K [S] a) • Situazioni limite: • [S] molto basse, • lim 0 • b) [S] verso la saturazione -Per [S] = Km , V = Vmax/2 Km = K-1 + K2/ K+1 - Per [S] >> Km, V = Vmax, reazione di ordine cinetico = 0 V= K

9. t ∫ ∫ [A] [A] - d[A]/[A] = kdt A0 A0 0 t ∫ ∫ - d[A] = kdt 0 CINETICA DEL 1° ORDINE Situazione limite a) 1° tratto della M & M Esempi generici - dS/dt = K [S], retta, Quando S << Km [S] scompare nel tempo secondo una curva esponenziale: integrando - dS/dt= k [S]: [A] = A0e-kt CINETICA DI ORDINE 0 Situazione limite b) in saturazione [A] dS/dt= K [A]=A0 -kt [S] scompare nel tempo secondo una retta con pendenza –k integrando - dS/dt= k tempo

10. Linearizzazione iperbole di Michaelis- Menten L’iperbole si può linearizzare, rendendo l’analisi dell’attività E più immediata e di più facile gestione pendenza Altre linearizzazioni: Hanes-Woolf; Eadie-Hofstee

11. Vmax e Km ADENOSINA DEAMINASI + H2O + NH3 idrolasi Inosina Adenosina Come si realizza in vitro il saggio di determinazione dei parametri cinetici di questa trasformazione Esistono diverse metodiche per determinare la velocità enzimatica di questa deaminasi – saggio spettrofotometrico: Abs 260/265 nm. A 260nm si misura l’Abs dell’adenosina; la velocità V0 dell’adenosina deaminasi, ovvero l’ estinzione a tempo iniziale dell’adenosina per effetto della trasformazione enzimatica in inosina, si misura invece a 265nm. Questo viene fatto per eliminare l’interferenza del prodotto, l’inosina, che assorbe a 260 ma non a 265 nm.

12. ESPERIMENTO: Vmax e Km dell’enzima Adenosina Deaminasi con metodo spettrofotometrico UV Si determina la V0 a varie concentrazioni di Substrato (adenosina), scelte al di sotto e al di sopra della Km attesa (30-40 mM): le concentrazioni di adenosina sono comprese tra 5 e 80 mM. S1: 5 mM S2: 10 mM Soluzione stock di partenza Adenosina 300 mM diluizioni S3: 20 mM S4: 40 mM S5: 60 mM S6: 80 mM a) Verifica concentrazione delle soluzioni preparate di adenosina: Spettrofotometro: si legge a 260 nm (UV) per verificare [Adenosina] mediante la e, coeff. di estinzione mmolare dell’adenosina = 0.015. A260nm/0.015= conc mM b) Calcolo della V0 dell’adenosina deaminasi: Si sposta la l di lettura da 260 a 265 nm e si aggiunge l’enzima Adenosina Deaminasi alle soluzioni di adenosina preparate per far iniziare la: + Adenosina Deaminasi Reazione: Adenosina Inosina In sostanza: per ogni solz. di adenosina, si calcola la v0: -dS/dt, DA/min, in 2 min d’intervallo di tempo: lo strumento misura l’Abs a 265nm ogni 10 sec in 2 min. DA nel tratto lineare: A(iniziale) – A(finale) sulla retta tangente alla curva di estinzione di A in funzione di t: si rapporta al min (DA/min).