Le complément

1. Le complément S3 L2 2012-2013 Cédric Ménard C3b C3b

2. Injection bactéries Le sérum du lapin contient des Ac contre les bactéries qui les tuent Bactéries tuées Sérum Définition du complément • Découverte scientifique (1895 Jules Bordet – Institut Pasteur- Nobel 1919) : - Sérum immun : bactéricide - Sérum immun chauffé : bactéries survivent - Sérum non-immun : bactéries survivent - Sérum immun chauffé + Sérum non-immun : bactéricide Injection bactéries Ces Ac contre les bactéries ont besoin de molécules du sérum sensibles à la chaleur pour tuer les bactéries Bactéries vivent Bactéries tuées Les Ac ont besoin d’ un élément sensible à la chaleur et indpdt de l’Ag pour pouvoir tuer les bactéries… Qui est cet élément ? Les Ac dirigés contre les bactéries sont indispensables pour pouvoir les tuer Bactéries vivent

3. Définition du complément • Complément = élément thermolabile du sérum, non spécifique de l’antigène, capable de « complémenter » les Ac pour éliminer bactéries • Branche de l’immunité innée • Complément = ensemble de plus de 30 protéines : • - plasmatiques (5% des protéines sériques) • - de surface cellulaire Complément = ensemble de protéines

4. Définition du complément • Protéines du complément produites par : • Foie (très majoritairement à l’état basal) • Macrophages (production utile dans les OLS) • Épithéliums muqueux et fibroblastes (faible) • Inactif dans le sérum, clivages en cascade des zymogènes confèrent activités enzymatiques • Deux types d’activateurs du complément : • complexes immuns = complexes Ag / Ac (Ac-dépendant) • sucres associés aux pathogènes (Ac-indépendant) • Trois voies : • classique (via Ac) • des lectines (sans Ac) • alterne (sans Ac) • Finalité : assurer la mort du pathogène : • DIRECTEMENT : rupture membranaire et choc osmotique • INDIRECTEMENT : en l’opsonisant = facilitant sa reconnaissance par le SI (Gram + à paroi)

5. Fragments de clivage enzymatique : lettre minuscule «C4 clivé donne C4a + C4b »Molécule inactive : désignée par i « C3bi ou iC3b »Formes enzymatiques actives : recouvertes d’une barre horizontale « C1r » I- Nomenclature

6. C1q C1s C1r II- Les voies d’activation La présence d’Ac spécifiques indique qu’une réponse contre l’Ag a déjà été initiée ! A- La voie classique (nécessite Ac) C1-estérase (Ca2+-dpdte) sérine-protéases C1r et C1s activées • C1 se fixe par C1q (protéine de reconnaissance) sur le Fc des anticorps impliqué dans des complexes immuns (région CH2 pour IgG1 et IgG3 et région CH4 pour IgM) • Activation par des complexes immuns à IgM pentamérique (3 sites pour C1) ou IgG (1 site pour C1 et donc plusieurs IgG nécessaires) • IgM 1000 x plus efficaces que les IgG pour activer C1 (passage forme plane à agrafe) IgG (IgG1 et IgG3) IgM IgG IgM Surface de la cible bactérie par exemple

8. II- Les voies d’activation A- La voie classique 1- Activation • Fixation C1 à l’anticorps via C1q • Activation autocatalytique du proenzyme C1r en C1r • C1r convertit C1s en C1s • C1s va cibler C4 circulant C4a + C4b (C4b s’ancre dans la membrane cible via thioester R-S-CO-R’) • C1s va cibler C2 associé à C4b C2a +C2b • C2a s’associe à C4b déjà ancré dans la membrane et donne C4b2a (=C4bC2a) • Ce complexe C4b2a = C3 convertase « classique » qui clive C3 en C3a + C3b (expose un thioester) covalent C2b C4a

9. C1-inh (détache C1r et C1s du complexe) II- Les voies d’activation A- La voie classique 2- Régulation • Contrôle de la C1-estérase par C1-inh : - empêche activation de C1r en phase liquide - peut inactiver le C1r activé • Thioester C3b et C4b hyper-réactif est hydrolysé en qqes ms par l’eau si non-fixé = obligation de se lier covalement au voisinage immédiat (= pas d’effet collatéral) • Complexe C4b2a instable = dissociation spontanée • Contrôle de la C3 convertase (C4b2a) : - C4-bp inhibe l’association C4b / C2 - CD55 = DAF « decay-accelerating factor » dissociation C4 / C2 (protection de l’hôte) - CR1 (CD35) = C3b-R peut titrer le C3b - Facteur I : clive C3b en iC3b

10. II- Les voies d’activation B- La voie des lectines : Ficoline et MBL (court-circuitent les Ac) • Activation : Mannan Binding Lectine (MBL) ou Ficoline reconnaissant sucres des pathogènes (mécanisme analogue à la C1 estérase qui reconnaît les complexes immuns) • Molécules effectrices : MBL-associated proteases = MASP (homologues de C1r/s) Reconnaît les sucres des pathogènes différents de ceux de l’hôte

11. Ac-indépendante ! II- Les voies d’activation B- La voie des lectines (Ficoline et MBL) 1- Activation • MBL ou ficoline fixe sucres cibles = MASP clivées / réarrangées et autoactivées (Ca 2+-dpdt) • MASP1 et 2 clivent C4 en C4a + C4b (qui s’ancre dans membrane) • MASP1 et 2 clivent C2 associé à C4b membranaire en C2a pour donner C4b2a • Formation de C4b2a = C3 convertase qui donne C3a + C3b (qui s’ancre dans membrane) • MASP3 (splicing alternatif de MASP1) : rôle encore flou

12. C1-inh II- Les voies d’activation B- La voie des lectines (Ficoline et MBL) 2- Régulation • C3b doit se fixer à un groupe hydroxyl (-OH) de son voisinage immédiat (sucre / prot memb) • Si absence de fixation, molécule H2O fixe C3b = ne peut plus lier une membrane cellulaire (C3b très instable) « But : éviter accumulation de C3b actif qui pourrait être délétère pour l’hôte (vrai aussi pour le C3b issu de la voie classique) » • MBL : forte affinité pour sucres bactériens, levures, virus : • Mannose • N-acétyl-glycosamine • Fucose • Mais MBL peu affine pour sucres de mammifères (propriétés stériques des sucres) : • Acide sialique • Galactose

13. C3 « L'hydrolyse d'une substance est sa décomposition par l'eau grâce aux ions H3O+ et HO- provenant de la dissociation de l'eau » II- Les voies d’activation C- La voie alterne (80% de l’activation du Cplmt) • Initiation indépendante d’activateurs = clivage spontané / lent de C3 à bas bruit en C3a + C3b • Phase d’amplification par des sucres bactériens (LPS, bactéries Gram+) ou des virus = déclenchement réel, « explosion » de la voie • La cascade s’amplifie sur les cellules étrangères mais est immédiatement régulée sur les cellules saines de l’hôte « La voie tourne au ralenti » Hydrolyse lente dans plasma C3b C3b

14. II- Les voies d’activation C- La voie alterne protéase C3b C3b 1- Activation • C3 hydrolysé à bas bruit et donne C3b • Liaison facteur B à C3b (Mg2+- dpdt) • C3bB est reconnu et clivé par la protéase « facteur D » • Clivage de C3bB en C3bBb = C3 convertase alterne • C3bBb clive C3 en C3a et C3b = constituant de la C3 convertase : AMPLIFICATION • La cible est « recouverte » par de nbreuses molécules de C3b (opsonisation) • Les C3b peuvent former de nouvelles C3bB • Stabilisation du C3bBb par la properdine (P) liant C3b (demi-vie 90 secondes vs 30 minutes), la properdine reconnaît les PAMP et les DAMP = des marqueurs de danger

15. II- Les voies d’activation C- La voie alterne 2- Régulation • Facteur H : dissociation C3bBb • Facteur I : en association avec le CD46 (=MCP : membrane cofactor Protein), clivage C3b en C3bi, = le facteur B ne peut plus se lier à C3b devenu C3bi «  De façon générale, dissociation des complexes de convertases est irréversible et permet de down-réguler la réponse du complément »

16. Récapitulatif • En dépit d’initiateurs différents, les 3 voies convergent vers une C3 convertase : • C4b2a pour la voie classique et la voie des lectines • C3bBb pour la voie alterne C3b C3b

17. III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune Voie classique Voie des lectines Voie alterne • Un fragment C3b s’associe aux C3 convertases et forme : • C4b2a3b • C3bBb3b C3 convertases C5 convertases Les C5 convertases permettant de cliver C5 en C5a + C5b (solubles)

18. III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune • C5b soluble s’associe à C6 et C7, le complexe hydrophobe ainsi formé s’insère dans la membrane cible via C7 • C5b67 ancré dans une membrane = récepteur à C8 ce qui aboutit à C5b678 qui initie une réaction lente de lyse • C9 (x environ 12) est recruté au complexe membranaire C5b678 pour constituer le MAC « membrane-attack complex »

19. 10 nm C9 Composition du MAC hétérogène : C5b6789n , n = 1 à 12 III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune • Perte de l’équilibre osmotique (l’eau rentre dans la cellule/le pathogène) • Mort mécanique de la cible Gram-negative bacterium Shigella dysenteriae

20. III- De la C3 convertase au complexe d’attaque membranaire : la voie effectrice commune Régulation • Régulation des voies d’activation est majoritaire mais la voie commune est aussi régulée : • C5b67 doit s’ancrer très vite dans la cible, sinon site d’ancrage inactivé • par hydrolyse • par fixation à protéines plasmatiques (protéine S = vitronectine ou clusterine) • C8 en se liant à C5b67 en phase liquide bloque le site d’ancrage dans la membrane • Plupart des membranes de l’hôte expriment CD59 qui se loge dans le CAM en cours d’assemblage = empêche la liaison de C9 = empêche formation du pore

21. IV- Le complément dans l’Évolution

22. B B V- Récepteurs cellulaires des composants du complément « ancrage » A- Récepteur fragments « majeurs » • CR1 = CD35 : Récepteur du C3b et du C4b (GR, Leucocytes, FDC) • Cibles opsonisées ou complexes immuns (GR) puis phagocytose par macrophages du foie (cellules de Kupffer) • Rôle d’atténuation en liant C3b et C4b • CR2 = CD21 : Récepteur de C3d (Lymphos B, FDC) • Reconnaissance des lymphos B par virus EBV • CD21 diminue seuil d’activation BCR et favorise survie B « fixation à un R » Reconnaissance via BCR Activation + Fragments iC3b = C3d Reconnaissance via BCR + CR2 Activation +++ (1000x plus efficace)

23. V- Récepteurs cellulaires des composants du complément B- Récepteur fragments « mineurs » • CR3= CD11b/CD18 : Récepteur iC3b (Majorité des leucocytes) • Molécule d’adhérence • Opsonisation / phagocytose bactéries ou cellules recouvertes de iC3b • Facilitation des contacts cellulaires • CR4 = CD11c/CD18 : Récepteur iC3b (Cellules myéloïdes et certains lymphocytes activés) • Molécule d’adhérence • Rôle physiologique peu connu C- Autres récepteurs (récepteurs à protéine G) • C3aR (éosninophiles, basophiles et neutrophiles) • C5aR (leucocytes et qqes autres types cellulaires) • C1qR

24. Reconnaissance accrue via CRs Phagocytose 100 x plus efficace Reconnaissance moyenne phagocyte phagocyte phagocyte cible cible cible cible Reconnaissance accrue via les R-Fc phagocyte Reconnaissance « maximale » via R-Fc + CR VI- Les autres rôles du complément Outre son rôle de lyse, le complément intervient dans : - l’opsonisation des pathogènes / C apoptotiques(perte CD46 et CD59) - l’activation de la réponse inflammatoire Ceci est permis par les 4 récepteurs aux fragments C3 du complément A- L’opsonisation • En facilitant la reconnaissance de l’Ag par les futures APC, le complément fait le lien immunité innée / adaptative cellulaire

25. VI- Les autres rôles du complément B- L’activation de la réponse inflammatoire • Les fragments de clivage C3a, C4a et C5a du compléments ne sont pas inactifs ! • Ces molécules sont nommées « anaphylatoxines » et permettent : • - d’augmenter la perméabilité vasculaire (rôle dans l’extravasation) • - d’activer la dégranulation des polynucléaires, mastocytes (histamine…), éosinoph • - la contraction des muscles lisses • - le chimiotactisme des cellules de l’inflammation : C5a attire les MΦ sur site inflammation et facilite ainsi la phagocytose des cibles (opsonines et cplmt-R) • - d’augmenter l’expression des FcgR des MΦ(C5a)

26. VII- Échappement au complément RCA = régulateurs de l’activation du complément (ex : DAF=CD55) Produits par l’hôte, ils peuvent être capturés à la surface du pathogène par des protéines spécialisées Protéine virale DAF humain Gène viraux peuvent coder pour des analogues de RCA ! « mimétisme moléculaire  » • Recrutement / mimicking des régulateurs du complément • - Modulation du complément (CD59-like, Ig inactivating-proteine…) • Dégradation enzymatique : bactéries uniquement (C1q, Ac, C5a, P…) • Evasion passive : paroi bactérienne des Gram + !

27. VIII- Pathologies associées au complément • Maladies génétiques liées à un déficit en complément sont rares : • déficits protéines de la voie classique • Infections récurrentes (méningites, pneumonies…) • Association fréquente au lupus • déficits protéines de la voie lectines et alterne : infection récurrentes • déficits protéines du MAC accompagnés d'infections à Neisseriameningitidis • déficits inhibiteurs donnent infections et des MAI

28. VIII- Pathologies associées au complément • HNP : Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne • Globules rouges plus sensibles à la CDC suite à une mutation génétique rendant CD59 non fonctionnel • Hémolyse : anémie, toxicité rénale • Eculizumab : IgG4 • Bloque le site de clivage de C5 (C5a)

29. Lymphocytes Natural Killer (NK)et T S3 L2 2012-2013 Cédric Ménard

30. Cinétique de la réponse immunitaire Anticorps T8 cytotoxiques NK T IFN de type I

31. Caractéristiques de l ’immunité innée et de l ’immunité acquise Mécanismes de reconnaissance de l ’immunité adaptative réponse lente (jours ou semaines) variable nbreuses spécificités hautement sélectives s ’améliore lors de la réponse Mécanismes de reconnaissance de l ’immunité innée réponse rapide (heures) invariable nombre limité de spécificités constant lors de la réponse Mécanismes effecteurs communs pour la destruction du pathogène

32. Les cellules Natural Killer « NK »

33. I- Caractéristiques générales • Grand lymphocyte granuleux • Fait partie de l’immunité innée : peut détruire rapidement des cellules tumorales ou infectées sans activation ni prolifération préalable • Distribution dans l’organisme : • Sang : 5-15% des lymphocytes circulant • Organes lymphoïdes : ganglions, rate, amygdales • Tissus périphériques : foie, poumon (« sentinelles »), endomètre • Expriment CD56, CD16, et NKp46 (pas CD3 ni CD19) • Production dans la moelle, maturation dans les organes lymphoïdes (ganglions ++) • Lymphocytes cytotoxiques mais aussi producteurs de cytokines/chimiokines

34. II- Ontogénèse et maturation des NK T NK matures Progéniteur Lymphoïde Commun NK CD56 high NK CD56 faible NK immature Progéniteur NK CSH Id2 E4BP4 sang B moelle Ganglions (paracortex)

35. II- Ontogénèse et maturation des NK • Rôle central de l’IL-15 dans toutes les étapes de la lymphopoïèse NK • Produite par les cellules stromales dans la moelle • Produite par les DC/macrophages dans les ganglions • “Education” des NK au cours de leur maturation • Doivent rencontrer un CMH-I au cours de leur développement • Nécessaire pour acquérir leur fonctionnalité KIR Maturation finale Potentiel cytotoxique et de sécrétion de cytokines NK immature KIR : Killer cell Immunoglobulin-like Receptor Anergie CMH-I

36. 2 sous-types de NK matures • CD56high - Dans les ganglions (CCR7+) et la muqueuse utérine - Peu cytotoxiques - Produisent beaucoup de cytokines • CD56low - Dans le sang principalement • Cytotoxiques (perforineds granules préformés) • Produisent moins de cytokines • Récepteurs aux chimiokines : migration dans les tissus surtout si inflammation

37. Cellules tueuses III- Reconnaissance de la cible T8 NK R act R inh CMH-I CMH-I • Pas restreinte à un complexe CMH-peptide • Résulte d’une balance entre : • Signaux inhibiteurs (tolérance au soi) : KIR inhibiteur vs CMH-I • Signaux activateurs : ligand = non soi/soi altéré • Répertoire NK : • Chaque individu diffère dans ses récepteurs KIR exprimé par ses NK (gènes polymorphiques) • Chaque NK a une combi ≠ de R inh et la plupart des NK a au moins 1 R inh (sinon, ils sont anergiques) • Existence d’une tolérance au soi = « nos propres NK ne nous attaquent pas » cible cible

38. Les récepteurs activateurs du NK • Exprimés constitutivement à la membrane des NK, reconnaissent des motifs moléculaires conservés • NKG2D (lectine de type C): cytotoxicité naturelle • Ligands : MICA et B, ULBP exprimés à la membrane lors d’un stress cellulaire : infection virale, transformation tumorale, lésions de l’ADN… • Natural Cytotoxicity Receptor (NKp30,44,46) : cytox nat. • Ligands : protéines virales (hémagglutinine ou pp65 du CMV) exprimées à la surface des cellules infectées • CD16 (FcgRIIIa) : cytotoxicité dépendante des anticorps • Ligand : cible reconnue par Ac qui se fixe sur son Ag spécifique • CD16 se fixe à la partie Fc de l’Ac • Autres : NKp44, DNAM-1, NKp80, 2B4…

39. Les récepteurs inhibiteurs du NK • KIR : Killer cellImmunoglobulin-likeReceptor • Famille de protéines codées par plusieurs gènes polymorphiques • Diffèrent par le nbre de Domaines Ig extracellulaires (2D ou 3D) et la taille de leur queue cytoplasmique (Long ou Short) • Les KIR2DL ou KIR3DL donnent un signal inhibiteur au NK • Ligand CMH-I spécifique pour chaque KIR2DL ou KIR3DL : • NKG2A : lectine de type C • Association obligatoire avec le co-récepteur CD94 • Ligand : CMH-I non classique : HLA-E

40. Les Récepteurs inhibiteurs Les Récepteurs activateurs IgG fixé à une cellule Molécules du stress cellulaire : - MICA - MICB - ULBP CMH-I • Protéines virales : • pp65 (NKp30) • hémagglutinine (NKp46) CMH-I type E KIR NCR NKG2D CD16 NKG2A CD94 ITIM ITAM • Signal activateur : ITAM recrutent des kinases (immune receptor tyrosine-based activation motif) • Signal inhibiteur : ITIM recrute phosphatases (immune receptor tyrosine-based inhibitory motif)

41. Balance entre signaux activateurs et inhibiteurs IgG Cytokines activatrices : IL-2-12-15-18 IFN CD16 Ag + prot. virales NCR + + MICA/B + ULBP NKG2D NKG2A HLA-E - - - Cytokines inhibitrices : TGF cellule cible KIR NK HLA-A,B,C,G

42. NK « Ce n'est pas l'absence de molécules du CMH de classe I qui déclenche l'activation des lymphocytes NK mais la présence de ligands activateurs non compensée par des signaux inhibiteurs suffisants » Balance des signaux act et inh • Ainsi, l'absence de molécules du CMH-I ne suffit pas à rendre certaines cellules sensibles à la lyse NK, par exemple : • globules rouges • neurones • hépatocytes

43. i a a Une cellule du soi est normalement protégée de la lyse NK car le signal inhibiteur l’emporte en général sur l’activateur ! Une cellule « suspecte » (qui n’exprime pas de CMH-I) est lysée car aucun signal inhibiteur ne vient contrebalancer l’activateur d Hyperactivation NK Lyse possible a cytokines i + a a a a a a CD16 Une forte activation des NK peut contrebalancer les signaux inhibiteurs (ADCC, IL-2…) Une cellule allogénique est lysée car le CMH-I du non-soi ne déclenche pas de signal inhibiteur

44. NK IV- Mécanismes effecteurs Les signaux activateurs l’emportent… que se passe-t-il ? • 1 - Lyse de la cible selon 2 systèmes : • - Perforine-granzyme • - Récepteurs de mort : Fas/FasL, TRAIL/TRAIL-R • 2 - Synthèse de cytokines : TNFa, IFNg, GM-CSF • - Orientation Th1 • - Contrôle direct de la réplication virale par l’ IFNg • - Activation MΦ et des DC • 3 - Synthèse de chimiokines inflammatoires : CXCL8, CCL3, CCL4, CCL5 donc recrutement de : • - PNN • - Macrophages • - DC immatures • - T activés ?

45. Cytotoxicité NK Voie perforine/granzyme Voie des récepteurs de mort TRAIL FasL TNF Perforine Granzyme B Fas TNFR-I TRAIL-R Apoptose de la cible

46. Voie intrinsèque Voie extrinsèque + BID clive apoptosome NOYAU

47. NK Receveur Toutes les combinaisons ne sont pas possibles !!! R act R inh Donneur cible V-Explications moléculaires de la réponse NK -1- Reconnaissance allogénique : - fondée sur la différence d’expression « KIR de l’hôte / CMH-I du donneur » = les CMH-I de l’hôte n’induisent pas le signal inhibiteur chez la NK qui ne les reconnaît pas. - Implication dans la greffe en général

48. NK V-Explications moléculaires de la réponse NK - 2 - Réponse anti-tumorale : • Pertes d’expression classe I sur 80% tumeurs (pas de signal inhibiteur, échappement tumoral) • Ligands des Récepteurs activateurs surexprimés en condition de stress (en surnombre ils déséquilibrent la balance vers l’activation) ULBP : UL16-binding protein MIC : MHC I polypeptide related

49. NK V-Explications moléculaires de la réponse NK - 3 - Réponse antivirale(EBV, CMV, Influenza…) : - Ligands de Récepteurs activateurs induits par infections virales (déséquilibre de la balance vers l’activation) - certains virus inhibent l’expression des CMH-I (herpesviridae, VIH…) Infection virale ULBP : UL16-binding protein MIC : MHC I polypeptide related

50. NK NK T8 cible cible Le « Missing-self » : la perte d’expression du CMH-I peut entraîner une activation des NK • La réponse cytotoxique par les T CD8 est CMH-I restreinte • Les cellules tumorales / infectées peuvent down-réguler l’expression du CMH-I pour éviter d’être reconnues par les T8 cytotoxiques T8 DOES NOT KILL KILLS KILLS cible NK = stratégie complémentaire aux T8 cytotoxiques pour lutter contre les cellules du non-soi ou soi altéré