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Sang/Moelle. tumeur. Cellule tumorale. ADN. ARN. PROTEINE. Marqueur. Diagnostic Pronostic. Réponse traitement. Rechute. Suivi. Temps. APL: Différenciation in vitro. Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM. Mauvais Répondeur. Bon Répondeur.

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Presentation Transcript

  1. Sang/Moelle tumeur Cellule tumorale ADN ARN PROTEINE Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Rechute Suivi Temps

  2. APL: Différenciation in vitro Culture des blastes leucémiques au diagnostic pendant 3-6 jours avec ATRA 0.1µM Mauvais Répondeur Bon Répondeur Cytologie Test NBT

  3. 1.0 1.0 0.8 0.8 Diff > 50% Diff > 50% P(relapse free) P(event free) 0.6 0.6 Diff<50% 0.4 0.4 0.2 0.2 P= 0.04 Diff<50% P= 0.01 0.0 0.0 0 500 1000 1500 2000 0 500 1000 1500 2000 days days 1.0 0.8 0.6 P(survival) 0.4 0.2 0.0 0 500 1000 1500 2000 days APL 93: Différenciation in vitro facteur de pronostic indépendant N= 77 Relapse-free survival Event-free survival Overall Survival Diff > 50% Diff<50% P= 0.10

  4. Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle _ _ +++ + + +++ PCR Applications de la PCR

  5. Translocations des APL PML-RARa PLZF-RARa NuMA-RARa NPM-RARa STAT5b-RARa t(15;17) insertions t(11;17) (q23;q21) t(11;17) (q13;q21) t(5;17) der(17) > 95% 1% 1 cas < 1% 1 cas RT-PCR RT-PCR ? ? ?

  6. Translocations t(15;17) Bcr3 Bcr2 Bcr1 Exons 3 4 5 6 7a 3 4 PML chromosome 15 RARa chromosome 17 Bcr1 : 60% Bcr2 : 10% Bcr3 : 30% RARa-PML exprimé chez seulement 75% des patients

  7. M7 O1 PML RAR O8 O7 PML RAR M7 R5 PML RAR Protocole de RT-PCR Nichée bcr 3 bcr 2 bcr 1 exon 3 exon 3 Points de Cassure t(15,17) PML RAR Diagnostic et MRD Typage PCR N°1 PCR N°2 bcr3 bcr2 bcr1 MW bp 2072 Bcr3 bcr2 bcr1 MW bp 600 2072 100 600 100 Sensibilité: 10-5 à 10-6

  8. 1 1 ,9 ,9 ,8 ,8 ,7 ,7 ,6 ,6 ,5 ,5 ,4 ,4 ,3 ,3 bcr2, bcr3 ,2 bcr2, bcr3 ,2 bcr1 ,1 bcr1 ,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 bcr2, bcr3 ,2 bcr1 ,1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Pronostic selon le typage Bcr Event-free survival Time to relapse after remission p= 0.06 p= 0.05 months months Overall survival N= 110 p= 0.05 months

  9. 70 Bcr1 60 Bcr2+3 50 40 30 20 10 0 Positif (%) Négatif (%) 50 50 Bcr1 40 40 Bcr2+3 30 30 20 20 10 10 0 0 Positif Négatif Positif (%) Négatif (%) RT-PCR standard après le diagnostic (APL93) 4 - 6 mois après diagnostic N = 84 Nombre de prélèvements % de prélèvements 50 40 total Bcr1 30 P= 0.61 Bcr2+3 20 10 0 Positif Négatif 12 mois après diagnostic N = 65 Nombre de prélèvements % de prélèvements total Bcr1 Bcr2+3

  10. 20 80% PCR positive PCR positive 15 60% PCR négative PCR négative 10 40% 5 20% 0 0% <50% >50% <50% >50% PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Différenciation in vitro au diagnostic N= 37 Nombre de Patients % de Patients P= 0.038 % de cellules différenciées à J3 de culture % de cellules différenciées à J3 de culture

  11. 35 100 rechute + rechute + (%) 30 rechute - 80 rechute - (%) 25 60 20 15 40 10 20 5 0 0 Positif Négatif PCR Positive PCR Négative PCR standard après 4 - 6 mois (APL93) et Risque de Rechute N= 84 Nombre de Patients % de Patients P= 0.010 Valeur Prédictive Négative= 82.5 %

  12. Approches par RT-PCR standard Sensibilité importante (10-6) - 50% des patients positifs après consolidation - 80% des patients négatifs post-conso ne vont pas rechuter - incapacité à prédire le pronostic des patients encore positifs - positivité de patients en rémission à long terme Sensibilité médiocre (10-4) - < 10% des patients sont positifs après consolidation : mauvais pronostic - incapacité à prédire le pronostic des patients négatifs: 30% des rechutes sont précédées d ’une PCR négative - forte probabilité (70%) de rechute des patients se repositivant - essai de traitement de la rechute moléculaire : allo BMT

  13. RT-PCR Quantitative en temps réel

  14. PCR quantitative en temps réel Idée: suivre l ’apparition des produits de PCR au fur et à mesure de leur formation et non plus en point final But: détecter le point de démarrage de la partie exponentielle de la réaction qui est proportionnelle à la quantité initiale de matériel Moyen: générer un signal fluorescent proportionnel à la quantité de matériel et suivre la fluorescence au cours de la réaction

  15. Agents Intercalants

  16. R R Sonde Taqman Polymérisation R = Reporter Q = Quencher Amorce sens R Q 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Amorce antisens R Déplacement du brin Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Clivage Q 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ Q Fin de la polymérisation 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’

  17. Miroir dichroïque Plaque 96 puits Multiplexer Lentille Source laser Fibres optiques Lentille Spectrographe REPRESENTATION DU SYSTEME DE DETECTIONDE LA FLUORESCENCE (Abi Prism 7700)

  18. Accumulation des produits de PCR Seuil Cycle Seuil = Ct

  19. Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10 Ct des différentes dilutions

  20. Gamme de plasmides: dilutions de 10 en 10

  21. Marqueur Diagnostic Pronostic Réponse traitement Rechutes Suivi Temps Diagnostic Rechute Maladie Résiduelle PCR Standard _ _ + + +++ +++ PCR Quantitative

  22. Protocole de RT-PCR Quantitative en temps réel Sonde Bcr1 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr2 1 2 3 4 5 6 RARa PML Sonde Bcr3 1 2 3 Normalisation par rapport à un gène de ménage: Housekeeping gene

  23. RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Comparaison Moelle - Sang

  24. RQ-PCR: intérêt potentiel : Gallagher et al. Blood 2003 Risque de rechute et DFS selon cutoff de positivité après consolidation

  25. RQ-PCR: nombre de copies au diagnostic et après 1 mois N= 25 107 106 105 Nombre de copies au diagnostic 104 103 102 10 Indétectable Diagnostic 1 mois

  26. 12 Positif 10 Négatif 8 Nombre de patients 6 4 2 0 <50% >50% % de cellules différenciées à J3 de culture RQ-PCR: Positivité et Différenciation au diagnostic 1 mois après le Diagnostic N= 15 p=0.022 Corrélation entre différenciation au diagnostic et positivité en RQ-PCR à 1 mois

  27. Suivi par RQ-PCR: Exemple de résultat Rechute 106 105 104 Nombre de Copies Normalisé 103 102 10 Indétectable Mois

  28. Conclusion Méthode de choix: RQ-PCR - quantifier la qualité des échantillons - suivi cinétique de la réponse au traitement - suivi cinétique d ’une re-positivation - évaluer des seuils Objectifs : - établir un schéma précis des temps de prélèvements - Sang ou moelle ? - établir des seuils prédictifs de l ’évolution des patients * seuil après traitement : Induction? Consolidation? * seuil de re-positivation * seuil de positivité d ’un échantillon pour autogreffe - standardisation Question : traitement de la rechute moléculaire? Arsenic?

  29. InductionConsolidationEntretienRémission Début Fin Fin 1/6 mois 1/6 mois Protocole de prélèvements dans la leucémie aiguë à promyélocytes • MOELLE • RQ-PCR EntretienRémission 1/3 mois 1/6 mois • SANG • RQ-PCR

  30. Références Bibliographiques - David Grimwade The significance of minimal residual disisease in patients with t(15;17) Best Practice and research Clinical Haematology Vol15, n°1, p137-158, 2002 - Grimwade D, Lo Coco F Acute promyelocytic leukemia: a model for the role of molecular diagnosis and residual disease monitoring in directing treatment approach in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2002 Oct;16(10):1959-73. - Gallagher RE et al. Quantitative real-time RT-PCR analysis of PML-RARa mRNA in acute promyelocytic leukemia: assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129 Blood Vol 101, n°7 p2521-2528, 2003

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