LE PHENOTYPE MUTATEUR DES RALSTONIA/ALCALIGENES METALLOTOLERANTES

1. LE PHENOTYPE MUTATEUR DES RALSTONIA/ALCALIGENES METALLOTOLERANTES Said TALBI(2,1), Yves MARKOWICZ (3), Safieh TAGHAVI (1), Hassan BRIM (2,1), Dirk SPRINGAEL(1), Daniel van der LELIE (1), Ariane TOUSSAINT (3,2), Max MERGEAY(1,2) (1)Milieutechnologie, VITO (Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek) Mol, Belgique (2)Laboratoire de Génétique des Procaryotes,ULB, Rhode-St-Genèse, Belgique (3) Laboratoire de Génétique Microbienne, Université Joseph Fourier, Grenoble, France

2. INTRODUCTION Dans divers sols ou sédiments de biotopes industriels ou miniers (Congo, Belgique, Allemagne) fortement contaminés par les métaux lourds, l’on peut trouver des bactéries porteuses des gènes czc, cnr ou ncc (résistances multiples aux métaux lourds) localisés sur de grands plasmides (180 à 300kb): une trentaine de ces souches ont été récemment assignées au moyen de techniques moléculaires au genre Ralstonia où elles forment un groupement susceptible de devenir sous peu une espèce distincte (Fig1). En attendant, elles portent la dénomination provisoire de “Ralstonia eutropha-oïde”.15 de ces souches sur 25 testées (Table1) à cet effet présentent un phénotype mutateur qui a surtout été étudié sur la souche CH34 et se révèle en particulier lorsque la souche est cultivée à 37°C (soit un degré avant d’observer une létalité complète). A cette température, seules 10-4 à 10-5. bactéries survivent. De 20 à 80% de ces survivants portent des mutations reconnaissables: les loci concernés (cartographiés pour la plupart) comprennent les gènes responsables de la synthèse de certains acides aminés (principalement la lysine : ce phénotype s’accompagne d’ailleurs d’une thermorésistance accrue et assez stable), de l’autotrophie, de l’utilisation de diverses sources de carbone et d’azote. Les mutants multiples ne sont pas rares. Une classe importante des mutations observées s’exprime par de profonds réarrangements des plasmides de résistance aux métaux lourds et fait intervenir des éléments transposables. Au vu de l’effet de la température et dans le but de préciser la base génétique et moléculaire du phénomène, nous avons cherché à savoir 1°) si DnaK/Hsp70,l’effecteur majeur de la réponse au choc thermique, joue un rôle. 2°) si le phénotype mutateur ne correspond qu’à un phénomène inductible à 37°C (notamment dans des cultures en milieu liquide) ou s’il a une portée plus générale.

3. Le genre Ralstonia • b-protéobactéries ; quelques nouvelles espèces à classifier. • Phytopathogènes : R. solanacearum (ex-Pseudomonas, ex-Burkholderia) IVc. • Chimiolithotrophes facultatif : H2+CO2: R. eutropha (ex-Alcaligenes eutrophus) I et II, HCOO- R. eutropha (ex-P. oxalaticus) I et II. • Souches des biotopes pollués par les métaux lourds (naturellement ou par acivité anthrpogénique), I et IVa. • Souches résistantes aux métaux lourds de la Nouvelle Calédonie (biotopes riches en nickel), III. • Souches cataboliques qui dégradent le PCB, 2,4-D (ex-A. eutrophus) II et III. • Isolats cliniques : R. pikettii, IVb.

4. Ralstonia eutropha CH34 • Métabolisme chimiolithotrophe. • Présence de deux mégaplasmides pMOL28 et pMOL30 qui conférent les résistances aux métaux lourds. • Capacité d’accepter et d’exprimer les gènes hétérologues. • Phénomène décrit comme TSP : Thermospontagenèse

5. Phénotype Tsp • Mutagenèse et Mortalité Induite à la Température : TIMM • Mortalité élevée à 37°C, 10-5 à 10-4 de survivants. • Tsp est observé à 37 °C sur milieu riche seulement ou sur milieu minimum additioné de méthionine. • 10 à 80% des survivants sont des mutants : • Auxotrophies, source d’energie, gènes cataboliques... • Réarrangements plasmidiens : délétions, pertes, génération de pMOL50-like accompagné de la sensibilité aux métaux lourds. • Les élements IS sont impliqués dans la Tsp(IS1086). • Tsp est régulé par un locus chromosomique. • D’autres stress comme la congélation et la coexistence des réplicons incompatibles induisent des mutations de type Tsp.

6. Distribution du phénotype Tsp parmi les souches Ralstonia métallorésistantes

7. Arbre phylogénétique ARDRA

8. Mutagenèse du gène dnaK I. Le gène dnaK de la souche CH34 («R.eutropha»/Alcaligenes ») et le phénotype mutateur Le gène dnaK a été cloné et séquencé ce qui nous a permis d’isoler un mutant qui n’exprime plus ce gène. A 33°C, la croissance de ce mutant dnaK est ralentie mais son compte viable n’est pas affecté ; le mutant ne pousse absolument plus à 35°C (Table 2). A 34°C, on observe la même mortalité qu’à 37°C pour le sauvage et avec un haut pourcentage de mutants parmi les survivants. Les phénotypes observés sont cependant différents : on n’observe pas de lys mais des auxotrophes pour le phosphate ou la sérine, types de mutants qui n’avaient jamais été observés jusqu’à présent. Mais aussi bien à 34°C chez le dnaK qu’à 37°C chez le sauvage on observe une fenêtre d’un degré avant la létalité complète, qui permet la sélection de mutants. Il semble aussi que la mutation dnaK n’affecte pas vraiment l’efficacité du phénotype mutateur ni même son fonctionnement.

9. Chinese hamster Ratus norvegicus C. elegans Eucaryotes, animaux et végétaux Hydra magnipapillata D.melanogaster Pavlova lutherii Cryptomonas phi Ondotella sinensis Thermus aquaticus Halobacterium cutirubrum Halobacterium marismortui Agrobacterium tumefaciens Rhizobium meliloti Caulobacter crescentus Burkholderia cepacia A. eutrophusCH34 Protéobactéries E. coli Salmonella typhimurium Hemophilus ducreyi Hemophilus influenzae Francisella tularensis Chlamydia trachomatis Borrelia burgdorferi Bacillus megaterium Bacillus subtilis Lactococcus lactis Staphylococcus aureus Clostridim acetobutylicum Bactéries à Gram+ Clostridium perfringens Methanosarcina mazei Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Streptomyces coelicolor Phylogénié basée sur la séquence de DnaK/HSP70

10. dnak22 dnak23 ATG TGA 1 2016 Gène dnaK chromosomique R U Plasmide suicide pPW78 contenant un U : amorce sens de pPw78 oriF plac pPw78:: dnak R : amorce antisens de pPw78 fragment du gène dnaK de 1227 bp. oriT Tet oriColE1 ~ 1200 bp = Recombinaison homologue et intégration dans le chromosome reverse dnak23 universel reverse dnak18 2016 ATG R U promoteur Tet pPw78 Chromosome Chromosome pPw78dnak Stratégie de mutagenèse

11. Réponse à la température du mutant dnaK- a) le mutant dnaK10 a été obtenu par recombinaison homologue avec un plasmide TetR contenant un fragment du gène dnaK de R. eutropha-like CH34. Les comptes viables d'AE2525 se font en présence de tétracycline. La fréquence de survie 1 correspond à un compte viable de 5 x 108; 0 = une fréquence inférieure ou égale à 2 x 10-11) (b) Croissance ralentie (c) Parmi 150 survivants à 34°C testés pour la présence de mutations : les phénotypes suivants ont été retrouvés : 7 Aut-, 9 Pho- (auxotrophes pour le phosphate), 1 Aut- Pho- , 1 Ser‑ et 1 Pro- (d) Après 5 jours d'incubation, quelques colonies apparaissent (suppresseurs ?).

12. Approches du phénotype mutateur en cultures liquides Les résultats rapportés (comptes viables et production de mutants dans 80 cultures (40 cultivées à 29° et 40 cultivées à 37°C) suggère que maintes mutations préexistent à 29°C et que le phénotype mutateur existe aussi à cette température. Mais apparemment seule l’exposition prolongée à 37°C permet de sélectionner certains phénotypes thermorésistants comme celui qui accompagne l’auxotrophie pour la lysine mais l’événement, qui cause cette mutation, semble pouvoir être généré aux deux températures. Par ailleurs, ces mutants lys- dont le compte viable sur boîtes est à peine affecté à 37°C affecté à continuent de muter à 37°C : ceci est observé aussi bien milieu liquide que sur boîtes :on peut donc apparemment séparer l’effet de mortalité de la mutagenèse et donc maintenir celle-ci à un niveau extrêmement élevé par rapport au compte viable. Cette observation pourrait trouver une application dans la mutagenèse dirigée (extension du spectre de dégradation de certaines familles de substrats récalcitrants).

14. Cultures en milieu liquide et production de mutants Une préculture en milieu minimal en fin de phase log. a été inoculée dans à 400mL de milieu LB (5.105 cell/mL) divisés en 80fractions de 5 mL incubées dans des tubes à essai: 40 à 29°C et 40 à 37°C. A la fin des temps indiqués, les cultures sont titrées aux deux températures et les comptes viables sont testés par répliques pour la présence de mutants. Les résultats des répliques présentés ici concernent une seule culture caractéristique ou significative. a)&c) Les cultures à 29°C ont un titre moyen de 2.109ufc/mL; leurs comptes viables ont une survie moyenne de 4.3.10-4(a) et 3,4.10-5(c). b)les cultures à 37°C sont quasi limpides ; titre moyen à 29°:1,1.103, à 37°: 13 ufc/mL. c) sur les 40 cultures à 29°C, seules 9 fournissent quelques mutants pour l’effectif testé (100 colonies): l’exemple montré indique la limite supérieure d)sur les 40 cultures à 37°C, 5 ne contenaient que des prototrophes (en fait des mutants thermorésistants), 1 que des Lys-, 1 que des Aut-, 11 étaient entierement mutantes avec une fraction de mutants doubles et multiples, 22 contenaient un mélange de mutants et de prototrophes.

15. CONCLUSION Ces observations induisent de nombreuses questions parmi lesquelles : - la température n’a-t-elle qu’un effet de sélection de certains phénotypes ou doit-on considérer qu’elle puisse aussi induire certains événements (remarquons à cet égard, que d’autres stress (comme la coexistence forcée entre deux réplicons incompatibles) génèrent dans la souche CH34 de hautes fréquences de mutants producteurs de mélanine (tyu-) ) ? - le phénotype mutateur (qui apparaît ici comme un caractère taxinomique) est-il vraiment lié à la survie dans des biotopes hostiles ? ; et dans ce cas, est-il une illustration d’un système vivant où une réparation de type SOS serait «surexprimée » pour garantir l’adaptation évolutive dans un environnement hostile à défaut d’une survie adéquate ? - les mutations qui sont générées par ce phénotype mutateur offrent-elles un avantage quelconque à la bactérie ? Peut-on utiliser ce phénotype pour une sélection de type «positif» ? - comment sont générées les mutations multiples comme celles que l’on observe dans les remaniements plasmidiens ?