380 likes | 672 Views
Molekulaarbioloogias kasutatavad meetodid :. Rakkude eraldamine ja kasvatamine Organellide eraldamine Makromolekulide (DNA, valgud) analüüs. Kasvajarakkude mikrodissektsioon koest laserikiire abil. Kiirelt kasvavate surematute tubakarakkude liini BY2 rakud vedelkultuuris.
E N D
Molekulaarbioloogias kasutatavad meetodid: Rakkude eraldamine ja kasvatamine Organellide eraldamine Makromolekulide (DNA, valgud) analüüs
Kiirelt kasvavate surematute tubakarakkude liini BY2 rakud vedelkultuuris
DNA märgistamine radioaktiivse isotoobiga (P32)(juhuslikud fragmendid)
DNA märgistamine radioaktiivse isotoobiga (P32)(fragmentide otste märgistamine)
Digoksigeniiniga märgistamineTümiini asemel selle analoog, milles metüülrühm on asendatud taimse steroidi digoksigeniiniga. Proov muudetakse nähtavaks digoksigeniini-spetsiifilise antikeha abil, mille küljes on nähtav marker (näiteks fluorestsentsvärv)
Nukleiinhapete hübridisatsiooni kasutamine mRNA molekulile vastav regiooni määramiseks genoomses DNAs • Näide: Kasutatakse intronite asukoha määramiseks genoomis • Vajalik on endonukleaas, mis lõikab ainult ühe-ahelalist nukleiinhapet • Analüüs toimub denatureerival agaroosgeelil
DNA-fragmendi sisestamine bakteriaalsesse plasmiidi ligaasi abil
Mingi DNA-järjestuse puhastamine ja paljundamine bakterisse kloonimise teel
Mingi liigi genoomse DNA kogu valmistamineGenoomset “raamatukogu” säilitatakse tavaliselt erinevaid selle liigi genoomse DNA fragmente sisaldavate bakterite koguna
Samast genoomse DNA regioonist valmistatud cDNA ja genoomse DNA kogude erinevus
DNA sekveneerimine e. nukleotiidse järjestuse määramine DNA ahelas
PCR (polymerase chain reaction) – polümeraasi ahelreaktsioon1. tsükkel
PCR (polymerase chain reaction) – polümeraasi ahelreaktsioonJärgnevad tsüklid
DNA-järjestuse alusel saab määrata valgujärjestuse ja vastupidi
Röntgenikiirte difraktsioon võimaldab määrata valgu täpse struktuuri
Valkude analüüs • Valgu molekulaarse struktuuri võib määrata tuumamagnetresonantsi abil • Valgu funktsioonide üle võib otsustada tema järjestuse võrdlemisel mõne tuntud funktsiooniga valgu järjestusega • Affiinsuskromatograafia ja immunosadestamine võimaldavad leida seostunud valke
Valgu funktsiooni uurimisel võib kasutada liitvalke (fusion proteins), samuti võib nende abil valku rakus lokaliseerida.
Valgu lokaliseerimiseks rakus võib tema külge siduda epitoobi (lühikese peptiidfragmendi, mille tunneb ära mingi antikeha)