ANALIZA METABOLITÓW ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z PODWYŻSZONĄ ZAWARTOŚCIĄ FLAWONOIDÓW

1. ANALIZA METABOLITÓW ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z PODWYŻSZONĄ ZAWARTOŚCIĄ FLAWONOIDÓW

2. BamHI HindIII SacI EcoRI Promotor GT NOS Petunia hybrida DFRa cDNA pBinAR Rośliny pGT/DFR • Promotor genu transferazy glukozowej (GT), gdyż: • jest regulowany czynnikami środowiskwymi • jest tkankowo-specyficzny • Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), gdyż: • DFR jest kluczowym enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanów

3. Celowość tworzenia roślin pGT/DFR Ekspresja genu DFR pod kontrolą promotora genu transferazy glukozowej pozwala na zwiększanie puli flawonoidów w roślinie: • w określonych tkankach • w określonych warunkach ( czynniki stresowe)

4. SEKWENCJE INDUKOWANE PROMIENIOWANIEM UV • sekwencja homologiczna z fragmentem promotora genu liazy fenyloalanyloamoniowej z pietruszkiCCCCTACAAACCCTT SEKWENCJE INDUKOWANE KWASEM ABSCYSYNOWYM (ABA) • E – boxy • sekwencja genu β – konglicyniny • motyw ABRE SEKWENCJE REGULOWANE ŚWIATŁEM • I – boxy • sekwencjaCCCCTACAAACCCTT • sekwencjaGAAAGAA • motywy GATA, GT1, G - boxy 1 AATTTAATTG ATAATACTTA CCTATTAAAT AAATTTCTTA AGATAAATAT AAATACAGAA 61 AATTGATTTG AATAATGCTA TTCAAGTCAT AGTGGCAAGA TTGAAGTAAA AAAAAAAAAG 121 AAATTGCATT TTATTTTATT TAGTTTTCAA ATTTAGTTCA TTATTTAGCT CAAAATATAT 181 CCAAATTAAG TTAAAATTTA CAATGTCAAT AACTAAAATA TAAAGTTTAT TTTTTTTAAA 241 AAAAAGAGAA CATTATATAT ATATTGATCC ATAGCATTTA ATGCCATAAA ATTTCCGTTA 301 ATAAAAGAAA GAGAACAACA TTCCATGTGG TGGTCAATAC ATATTCGGTA TATCATGTGA 361 CAATTATTAA TGACGAATTT AAAATTTAAA TTTTATAAAT TTAAAACTAA CTTATTATAT 421 TTTTAAAGTT ACAAATCCAT AATTACTAGT ATATTTATTA CAATTTGAAT AATATTTTAT 481 ATATAAATTA ATTTTTTACG TTAAAAATAT TATATTCAAA AGAACTCGAT ACTATGACGT 541 TAGATCAGCC CGTGATAGAT GCATCAAAAT CCATGCCCAA CTTCAATCTC TACATTGTAT 601 CTGGCTATCC TAGATTAGGC AGTAGCTTGC CAGAAGTTTT TATTTTTATA ATAATTGAAT 661 TAAAAAATAA TAATAACAGA AACATATTCC AGACAACTCA TGTCATGCAT GACAAATTCT 721 GAAATTGGGC TTACTGGCTA CTGCTGAAAG GTATGGCTCA CTAACCAAAA TAAAATACTA 781 GTGCCCACAA CGAGTGATGG AGTGGTAAGA TTACTCTGTC TTTAGTAAAG ATCTGGAATT 841 TCAATTTTAA ATATGAAGAA AATTTGGTTA GGAGTATCAC TCCCAAATGA GCTTTGCATT 901 GCACGATTCG AATTTAGGCG AAGGTCCAGC GGTGAGAAAC TACCAAACAC AATCCATACA 961 ATAGTAGAAT TTATTTATTT TCTTGCATCA ATTTGTTTTT CTTTTTTTAG ACCGTTTGAT 1021 AAAAATGTCT TTTTTCCTTT TTGATAATTA TTTAATTTTT GATTTTTTAC ATGATATATT 1081 TAAAATTAGA GAATTAAAGA ACGTTTTAGT ACATATATTT AATTTAAGAT TTTAAAACTT 1141 AAAAGTCTTA TTTTCTTTTG TAAATTACGT ATCAAATTAA AATTAGTTAA ATAAATAAAA 1201 ACAAAATATT TGTTTTGCAA GTAAGATAAA TAGTCACTCT CTTCTGTCCA TCTGGTGTTT 1261 TTTCTATAGA ATTAAATAAA TTAAAAGAAA GAAACAAAAA CGAAGTACCG GCAAAATTTG 1321 TCTTCTCATC AATTTCGTCA CCTCAAACGT CATATGACAT GCATGTGTTT AAATTTGGTC 1381 CTCAAACATG TTACTCAAAC GTAGAAATGG ACATGATGGG ATAGATATTG AAATTTTTAC 1441 TAACGTAACG TGCTCACCCCTACAAACTCCTTATATATAT CCCTCTAACT ATCATCATAT 1501 ATACCACACA ATAATTAAGA GTCTTACAAG TCAAAGATTT CTCTCACACA ATACTAAAGT 1561 CTACTTTCAT TCATTTGACC TCGAACTTTG AACTTAGGTT CTATTTTAAG TTTGTGAGTG 1621 TAAAAATG

5. 5,5 X próba kontrolna próba naświetlana UV-C PROMIENIOWANIE UV

6. pGT/GUS, 22C pGT/GUS, 4C 6 X NISKA TEMPERATURA

7. 8 X pGT/ GUS pCaMV35S/ GUS KWAS ABSCYSYNOWY

8. pGT/ GUS pCaMV35S/ GUS 5 X ŚWIATŁO

9. KORZEŃ LIŚĆ BULWA • miękisz gąbczasty • miękisz palisadowy - cortex - cortex - komórki przy wiązkach przewodzących

10. DFR / dihydroflavonol 4-reductase -katalizuje reakcję redukcji dihydroflawonolu do leukoantocyjanidyny

11. Konstrukt DFRanty Konstrukt DFR EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII promotor terminator CaMV35S OCS Petunia hybrida DFR cDNA DFRa Desi DFR EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII promotor terminator CaMV35S OCS Petunia hybrida DFR cDNA

12. Potencjał antyoksydacyjny (IC50) Zawartość antocyjanów

13. Zawartość kwasów fenolowych

14. BamHI HindIII SacI EcoRI Promotor GT NOS Petunia hybrida DFRa cDNA pBinAR Rośliny pGT/DFR • Promotor genu transferazy glukozowej (GT), gdyż: • jest regulowany czynnikami środowiskwymi • jest tkankowo-specyficzny • Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), gdyż: • DFR jest kluczowym enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanów

15. Analiza roślin pGT/DFR

16. Preselekcja metodą PCR A) PRIMERY NA KANAMYCYNĘ B) PRIMERY NAMNAŻAJĄCE GEN DFR SEKWENCJA PRIMERÓW: DFRAR 5'- GGT GCA TTC TCT TTG CCA CTT GC-3’ DFRAF 5‘ - GAC AGT TTG CGT CAC TGG AGC TG-3’ SEKWENCJA PRIMERÓW: GMO6/1 5’ – CCGACCTGTCCGGTGCCCC-3’ GMO6/2 5’ - CCGCCACACCCAGCCGGCC-3’ H20 Desi BinAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H20 Desi DFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1,5 kb 0,5 kb Selekcja roślin pGT/DFR

17. Desiree pGT/DFR Analiza fenotypowa Kwitnienie roślin: 6. 07. 2004

18. Wstępna analiza metabolitów metodą GCMS

19. 2 PEP heptuzolonian - 7P D - erytrozo - 4P + quinian szikimian cykl pentozowy glikoliza choryzmian Phe antranilan prefenian flawonoidy Tyr indol Trp POZIOM AMNOKWASÓW

20. raffinose, gums, gluconeogenesis ononitol pinitol myo-Inositol phospholipids, phosphoinositides, phytate myo-Inositol-1P mannitol mannitol-1P Fru6P Glc-6P sorbitol-6P oxaloacetate citrate sorbitol malate cis-aconitate pyruvate fumarate isocitrate succinate 2-oxoglutarate Arg Pro metabolism Tyr metabolism Protektanty w warunkach stresu

21. warunki kontrolne chłód ABA UV

22. CO BĘDZIEMY ROBIĆ: • pomiar poziomu antocyjanów w roślinach pGT/DFR poddanych działaniu czynników stresowych (ABA, UV, CHŁÓD) • oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego (IC 50) w stresowanych roślinach pGT/DFR

24. Potencjał antyoksydacyjny (IC 50) Wpływ promieniowania UV na właściwości antyoksydacyjne roślin z nadekspresją DFR rośliny CaMV35S/DFR /kontrola rośliny CaMV35S/DFR/naświetlane UV

25. Funkcje flawonoidów ODPOWIEDŹ NA STRESY ABIOTYCZNE I BIOTYCZNE • ochrona przed UV • odporność na patogeny