第五节乙肝五项指标检测（ELISA双抗体夹心法）

第五节 乙肝五项指标检测（ELISA双抗体夹心法）一、目的和要求掌握乙肝五项指标检测的ELISA方法。

二、内容 （一）原理乙型肝炎的微生物学检查中以抗原抗体检测最常用，其中尤以酶联免疫吸附试验（ELISA）为主，采用双抗体夹心法（一步法）。如乙肝表面抗原（HBsAg）检测：包被马抗-HBs的单克隆抗体于微孔板上，血清标本中HBsAg与其结合后，再加入辣根过氧化酶（HRP）标记的抗-HBs，结果形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入酶的底物后使底物显色。

（二）材料 1.疑似乙型肝炎患者待检血清。 2.检测HBV“两对半”血清标志（HBsAg）的ELISA试剂盒：包被有相应抗体或抗原的反应条，酶结合物，阳性与阴性对照，洗涤液，显色剂A、B，终止液。

（三）操作方法 参照所购试剂盒的操作说明书进行 1.乙肝表面抗原（HBsAg）检测（1）每孔加待测血清50μl，每板设HBsAg阳性、阴性及空白对照各一孔；再向每孔加入酶结合物50μl（空白孔不加），用不干胶封孔后，37℃水浴30min。（2）弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复5次。（3）每孔加显色剂A、B各一滴，37℃孵育10min后加终止液一滴（2mol/L H2SO4，50μl），终止反应。

结果判断： （1）目测法：阳性对照呈蓝色、阴性及空白对照为无色，以此为依据来判断标本孔。（2）比色法：以空白孔调零，用酶标仪测492 nm吸光度，读取各孔A值，以标本吸光度A值/阴性对照吸光度A值 ≥ 2.1者判为阳性。

2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）、e抗原（HBeAg）检测2.乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）、e抗原（HBeAg）检测取出相应检测试剂盒中的包被板（或条）进行同1的操作，结果观察亦同1（略）。

3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）、e抗体（抗-HBe）检测3.乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）、e抗体（抗-HBe）检测（1）抗-HBc检测先用生理盐水将待测血清作1:30稀释，然后取50μl加入相应的包被板（或条）中，同时设阳性、阴性及空白对照各一孔（对照血清不必稀释）；再向每孔加入酶结合物50μl（空白孔不加），再进行同1的操作。但结果观察需反看：目测法是以不显色（无色）孔为阳性；比色法是以标本吸光度A值>0.5N（阴性对照值）为阴性，标本吸光度A值≤0.5N者判为阳性。

（2）抗-HBe检测 取出相应的包被板（或条），每孔加待测血清50μl，同时设立对照，每孔加中和试剂50μl（试剂盒中配备），再加入酶结合物50μl（空白孔不加），然后进行同抗-HBc检测的操作过程，结果观察亦同抗-HBc，需反看。

三、作业 撰写实验小论文1篇。四、思考题简述乙肝五项指标各自的医学意义？（黄升海）

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