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Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo

Aplicação presentes e futuras na Alergologia. Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo. Introdução.

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Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo

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Presentation Transcript

  1. Aplicação presentes e futuras na Alergologia Teste de Activação de Basófilos por Citometria de Fluxo

  2. Introdução • O diagnostico das reacções alérgicas na prática medicinal resulta tanto do historial clínico como de testes e demonstrações a imunoglobulinas E específicas do soro e dos tecidos do indivíduo. • BAT

  3. Princípios • Basófilos são granulócitos que representam menos de 1% dos leucócitos. • A activação do basófilo pode seguir dois caminhos principais: a degranulação anafilática (AND) e a degranulação fragmentada (PMD), caracterizada por alterações morfológicas e secreção do conteúdo do grânulo sem exocitose. • Marcadores principais: FcεRI, CD36,CD203c, P38 MAPK

  4. Colheita e Preservação • Uso até 3H após a recolha, tubo sem endotoxinas, anticoagulante EDTA ou heparina e temperatura ambiente • Uso ate 24H após a recolha, anticoagulante EDTA e temperatura 4ºC

  5. Sangue Total ou Basófilos Isolados • É simples isolar os leucócitos do sangue total, utilizando técnicas de centrifugação e de gradientes de densidade.

  6. Condições de Estimulação • Após a estimulação, os basófilos reagem imediatamente, se as condições se encontrarem ideais. • O pré-aquecimento de sangue, bem como o contacto com os reagentes por 15 min a 37ºC melhora significativamente a latência e magnitude de anti-IgE mediada por CD63.

  7. Marcação com IL-3 • Alguns autores têm mostrado que uma curta pré-incubação com IL-3 pode aumentar a sensibilidade dos ensaios baseados em CD63, mas esta medida não parece ser crucial para os potentes alérgenos proteicos e de estimulação com soro de pacientes com urticária auto-imune.

  8. Estimulação do Controlo Positivo e Negativo • Para que haja uma interpretação correcta da BAT é necessário ter em conta a influência dos estímulos positivo e negativo. • Tradicionalmente, o controlo positivo é um anticorpo policlonal ou monoclonal anti-IgE. • Na ausência de estimulação controle positivo, torna-se impossível interpretar correctamente os resultados negativos das reacções alérgicas.

  9. Estimulação do Alergénio • A análise de fluxo assistida e quantificação in vitro de basófilos activados geralmente depende da utilização de extractos de alérgenos naturais.

  10. Experiência de dosagem • As respostas dos basófilos podem ser extremamente heterogéneas entre diferentes indivíduos. • No entanto, a fosforilação de alérgenos específicos de p38 MAPK, de CD63 eCD203c geralmente não é restrita a um único estímulo, mas implica diferentes concentrações de estimulação que se estendem por várias escalas.

  11. Marcadores de Identificação • Na maioria dos estudos correntes foi aplicado um anticorpo anti-IgE na amostra de sangue periférico com o objectivo de identificar os basófilos. • Como outras células do sangue podem ser apresentar este anticorpo, para o estudo de citometria de fluxo a amostra deve contem CD203c, uma vez que a expressão desta é exclusiva da superfície dos basófilos.

  12. Marcadores de Activação • No presente, os marcadores de activação mais utilizados são CD63 e CD203c.

  13. Análise de Basófilos do Paciente • Actualmente, a análise de fluxo assistida e quantificação de basófilos activados in vitro mostrou-se sensível e específica para o diagnóstico de várias alergias mediadas por IgE, incluindo os clássicos alérgenos inalantes (ácaros, epitélio do gato, e pólen), alergia ao veneno de hymenoptera, alergia natural ao látex de borracha, alergias primárias e secundárias a alimentos e medicamentos.

  14. Análise de Basófilos de dadores atópicos • A análise de fluxo assistida e quantificação de basófilos in vitro activados também pode ser aplicada em células obtidas de indivíduos atópicos

  15. Aplicações da Pesquisa • A citometria de fluxo pode fornecer resultados referentes à dose de respostas e cinética de fosforilação de p38 MAPKqualitativamente similares aos dados obtidos com a técnica Wesern-blot. • A citometria de fluxo oferece diferentes oportunidades que a tornam maisadequado para aplicação clínica.

  16. JOANA VINES, CIÈNCIA VIVA, FACULDADE DE CIÈNCIAS MÉDICAS DE LISBOA Conclusão, perspectivas, pontos de vista especulativos

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